चूहा मस्तिष्क ऊतक के लिए एक हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधि
Summary
यहां हम एक हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधि पेश करते हैं जो अक्षुण्ण मस्तिष्क संरचनाओं के हिस्से के रूप में लक्ष्य अणुओं को देखने की अनुमति देता है। इस तकनीक को अब F344/N नियंत्रण और एचआईवी-1 दोनों लिंगों के ट्रांसजेनिक चूहों के लिए मान्य किया गया है ।
Abstract
हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधियां आसानी से समायोज्य, तेज और कम लागत वाली प्रक्रियाएं हैं जो अनछुए ऊतक नमूनों में रुचि के अणु के अध्ययन के लिए अनुमति देती हैं। पारंपरिक इम्यूनोलाबेलिंग प्रक्रियाओं को नमूने को पतले वर्गों में काटने की आवश्यकता होती है, जो अक्षुण्ण संरचनाओं को लेबल और जांच करने की क्षमता को प्रतिबंधित करता है। हालांकि, यदि प्रसंस्करण के दौरान मस्तिष्क के ऊतक बरकरार रह सकते हैं, तो विश्लेषण के लिए संरचनाएं और सर्किट बरकरार रह सकते हैं। पहले स्थापित समाशोधन विधियों को ऊतक को पूरी तरह से साफ करने में महत्वपूर्ण समय जाता है, और कठोर रसायन अक्सर संवेदनशील एंटीबॉडी को नुकसान पहुंचा सकते हैं। iDISCO विधि जल्दी से और पूरी तरह से ऊतक को साफ करता है, कई एंटीबॉडी के साथ संगत है, और कोई विशेष प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता है। इस तकनीक को शुरू में चूहों के ऊतकों में उपयोग के लिए मान्य किया गया था, लेकिन वर्तमान प्रोटोकॉल इस विधि को नियंत्रण और ट्रांसजेनिक चूहे के दिमाग के छवि गोलार्द्धों के लिए अनुकूलित करता है। इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल कम पृष्ठभूमि धुंधला के साथ स्पष्ट छवियों को प्रदान करने के लिए पहले से मौजूद प्रोटोकॉल के लिए कई समायोजन भी करता है। वर्तमान हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधि का उपयोग करके एचआईवी-1 ट्रांसजेनिक चूहे में और F344/N नियंत्रण चूहों में आईबीए-1 और टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज के लिए एंटीबॉडी मान्य थे । मस्तिष्क एक इंटरबुने नेटवर्क है, जहां संरचनाएं एक दूसरे के अलग से अधिक बार एक साथ काम करती हैं। व्यक्तिगत टुकड़ों के संयोजन के विपरीत एक पूरी प्रणाली के रूप में मस्तिष्क का विश्लेषण करना इस पूरे मस्तिष्क समाशोधन विधि का सबसे बड़ा लाभ है।
Introduction
हाइड्रोजेल, हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक: मस्तिष्क में उपयोग के लिए कई ऊतक समाशोधन तकनीकों को मान्य किया गया है। इन तकनीकों का उद्देश्य सॉल्वैंट्स के प्रशासन के माध्यम से परिसीमन, विच्छेदन और डिक्लेरेशन के माध्यम से एक ऊतक को पारदर्शी बनाना है। एक बार जब ऊतक नमूने का अपवर्तक सूचकांक चुने गए इमेजिंग माध्यम के अपवर्तक सूचकांक से मेल खाता है, तो नमूने की एक स्पष्ट छवि प्राप्त की जा सकती है। स्पष्टता जैसी हाइड्रोगेल आधारित तकनीकें ऊतक में एक्रिल-आधारित हाइड्रोगेल से जोड़कर जैव अणुओं को सुरक्षित करती हैं, जो संरचनात्मक क्षति और प्रोटीन की हानि को रोकती है1। हालांकि, हाइड्रोगेल तकनीक कठोर रसायनों का उपयोग अधिक नाजुक ऊतकों को नुकसान पहुंचाने की क्षमता से होती है, और डेंजर ऊतक नमूने हाइड्रोगेल प्रोटोकॉल के साथ संगत नहीं हो सकते हैं। कुछ हाइड्रोगेल तकनीकों को महंगे उपकरणों की आवश्यकता हो सकती है या ऊतक विस्तार का कारण बन सकता है। क्यूबिक जैसी हाइड्रोफिलिक तकनीकें ऊतक 2 के भीतर हाइड्रोजन बांड के गठन के माध्यम से 3 डी संरचना कोसंरक्षितकरते हैं। ऊतक विस्तार भी कुछ हाइड्रोफिलिक प्रोटोकॉल में हो सकता है। हाइड्रोफिलिक तकनीकों की समाशोधन क्षमता अक्सर हाइड्रोफोबिक तकनीकों की क्षमता से मेल नहीं खाती है, जो डेंजर और मोटे ऊतकों के लिए महत्वपूर्ण है3।
हाइड्रोफोबिक तकनीक आमतौर पर तेज होती है, विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, और एक नमूना पेश करती है जिसे संभालना और स्टोर करना आसान होता है। आईआईडस्को एक हाइड्रोफोबिक तकनीक है जो अन्य हाइड्रोफोबिक प्रोटोकॉल में होने वाली सिकुड़न को समाप्त करती है। मूल रूप से, iDISCO ऊतक समाशोधन तकनीक Renier एट अल द्वारा वर्णित किया गया था4 भ्रूण और घने, चूहों के वयस्क अंगों के लिए । यह तकनीक शुरुआती डिहाइड्रेशन स्टेप में टिश्यू से पानी निकालती है, जिससे लाइट स्कैटर कम हो जाती है। ऊतक को प्रीट्रीटमेंट के दौरान गहरे एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति देने के लिए पार किया जाता है। सुदूर लाल स्पेक्ट्रम में एलेक्सा फ्लोर रंगों का उपयोग कम तरंगदैर्ध्य 5 पर ऊतक के ऑटोफ्लोरेसेंस से बचने के लिए इम्यूनोलबेलिंग के लिए कियाजाताहै। ऊतक जो हाइड्रोफोबिक समाशोधन प्रोटोकॉल से गुजरा है, आसानी से संभाला जा सकता है और एलेक्सा फ्लोर रंगों की दीर्घायु के कारण कई बार इमेज किया जा सकता है। यदि ठीक से संग्रहीत किया जाता है, तो ऊतक प्रारंभिक प्रसंस्करण के बाद महीनों से एक साल तक छवियां प्रदान कर सकते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल में नर और महिला नियंत्रण और एचआईवी-1 ट्रांसजेनिक (टीजी) चूहे के दिमाग पर टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच) एंटीबॉडी, आईबीए1 एंटीबॉडी और हैजा टॉक्सिन सबयूनिट बी (सीटीबी) का इस्तेमाल किया गया । एचआईवी-1 टीजी चूहे में नौ जीन में से सात होते हैं जिनमें एचआईवी-1 वायरल जीनोम शामिल होता है, जो लंबे समय तक एचआईवी-1 प्रोटीन एक्सपोजर6, 7, 8के गैर-संक्रामक मॉडल की ओरजाताहै। डोपामिनेर्गिक परिवर्तन पहले एचआईवी-1 टीजी चूहे में प्रदर्शित किए गए हैं, और एचआईवी-1 अपने आप में एक भड़काऊ बीमारी है, इसलिए एंटीबॉडी विकल्प प्रायोगिक डिजाइन9,10, 11,12के लिए प्रासंगिक था। सीटीबी एक ट्रेसर है जो गैंगलियोसाइड बाइंडिंग के माध्यम से न्यूरॉन्स को देता है और मस्तिष्क में अफरेंट अनुमानों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सीटीबी का उपयोग पहले नाभिक एकुम्बेंस से लेकर सबस्टेंटिया निगरा क्षेत्र तक के अनुमानों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, मस्तिष्क के दो क्षेत्र 13 ,14,15के साथ भारी रूप से शामिल होते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, TH डोपामाइन उत्पादन के लिए एक मार्कर के रूप में काम करेगा, और Iba1 सक्रिय माइक्रोग्लिया को चिह्नित करेगा। टीएच एंटीबॉडी का उपयोग लगभग 62 केडीए पर एक बैंड को चुनिंदा रूप से लेबल करता है जो टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज से मेल खाता है। Iba1 एंटीबॉडी Iba1 कार्बोक्सी-टर्मिनल अनुक्रम से मेल खाती है। दोनों एंटीबॉडी खरगोश में उठाए गए थे और पॉलीक्लोनल थे। सीटीबी का उपयोग नाभिक एक्यूबेन्स क्षेत्र से सबस्टेंटिया निगरा क्षेत्र तक न्यूरॉन्स के प्रतिगामी ट्रेसिंग के लिए किया जाएगा। वर्तमान प्रोटोकॉल दो अलग-अलग तरीकों से मूल पहचानो प्रोटोकॉल के समायोजन के लिए एक दिशानिर्देश भी प्रदान करता है: 1) अवरुद्ध चरणों में सीरम अभिकर् म को बदलकर पृष्ठभूमि धुंधला की समग्र कमी, और 2) बड़े ऊतक नमूनों के लिए उपयुक्त होने के लिए इनक्यूबेशन समय की स्केलिंग। कुल मिलाकर, वर्तमान प्रोटोकॉल निरंतर सबूत प्रदान करता है कि हाइड्रोफोबिक समाशोधन तकनीक चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों में संभव है, एचआईवी-1 वायरल प्रोटीन के साथ कोई प्रत्यक्ष हानिकारक बातचीत नहीं है, और टीएच एंटीबॉडी, Iba1 एंटीबॉडी और सीटीबी के साथ संगत हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊतक समाशोधन पारंपरिक आईएचसी प्रोटोकॉल की सीमाओं का समाधान प्रदान करता है। एक नमूना जो पारदर्शी होता है, प्रकाश के बिखरने और अवशोषण को कम करता है, जो18,19को अक्षुण्ण ऊतकों तक सेलुलर ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 और T32 प्रशिक्षण अनुदान द्वारा 5T32GM081740
Materials
| Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C34775 | |
| DBE | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| DCM | Sigma-Aldrich | 270997-100mL | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-1L | |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-500 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Goat serum | Sigma Life Science | G9023-10mL | |
| Heparin | Acros Organics | 41121-0010 | |
| Iba1 primary antibody | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| Kwik-sil epoxy | VWR | 70730-062 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1l-R | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP2944-100 | |
| Perfusion machine | VWR | 70730-062 | mini pump variable flow |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-3KG | |
| TH primary antibody | Millipore Sigma | AB152 | |
| TritonX-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Tween-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
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