分子分析的谷类区域解剖
Summary
不同的小脑区域被牵连到不同的行为输出中发挥作用，但潜在的分子机制仍然未知。本文描述了一种可重复和快速解剖半球、前部和后部区域以及深小脑核的方法，以便通过分离RNA和测试基因表达差异来探测分子差异。
Abstract
Cerebellum 在控制运动、平衡、认知、奖励和影响等几个关键功能中起着重要作用。成像研究表明，不同的小脑区域有助于这些不同的功能。研究区域小脑差异的分子研究是滞后的，因为它们大多是在整个小脑提取物上完成的，从而掩盖了特定小脑区域之间的任何区别。在这里，我们描述了一种可重复和快速剖析四种不同小脑区域的技术：深小脑核（DCN）、前体和后脑小脑皮层以及半球小脑皮层。剖析这些不同的区域可以探索分子机制，这些分子机制可能是它们对平衡、运动、影响和认知的独特贡献的基础。该技术还可用于探索不同小鼠疾病模型中这些特定区域的病理易感性差异。
Introduction
小脑包含超过一半的神经元在大脑中，历史上被称为运动控制和平衡中心在大脑1。最近，研究表明，小脑在认知、奖励处理等各种其他功能中起着关键作用，并影响2、3、4、5。
小脑有很好的解剖学：皮层区域由颗粒、普金耶和分子层组成。颗粒细胞形成颗粒细胞层，并通过平行纤维将输入发送到分子层的Purkinje细胞树突，该分子层的Purkinje细胞树突也从源自劣质橄榄的攀爬纤维中接收输入。Purkinje细胞向深小脑核（DCN）中的细胞发送抑制性投影，而深小脑核是小脑的主要输出。这种小脑回路的输出进一步调节在小脑皮层的抑制内周素的活动，包括高尔吉，石柱和篮子细胞4。这个小脑功能单元分布在小脑皮层的所有叶。尽管小脑的电路相对统一，但人类神经成像文献和患者研究表明小脑6、7的功能异质性。
小脑皮层可分为两个主要区域：中线定义的紫杉和横半球。紫杉可以进一步分为前叶和后叶。小脑的这些不同区域与促成不同行为有关。任务唤起或无任务的活动模式牵连到，前区域的vermis对运动功能的贡献更大，而后维米斯对认知6，7的贡献更大。真语也与影响和情绪有关，而小脑半球有助于执行，视觉空间，语言和其他助记符功能8。此外，解剖学研究提供了证据，功能上不同的小脑区域与不同的皮质区域9有关。病变症状映射显示，影响前叶（延伸至叶六）的中风患者在精细运动任务上表现较差，而后叶区域和半球受损的患者在没有小脑运动综合征10的情况下表现出认知缺陷。最后，区域小脑病理学表明，功能上不同的小脑区域也不同易患11、12病。
虽然探索较少，但初步证据表明，小脑皮质区域有不同的基因表达特征。Zebrin II的Purkinje细胞表达在动词中显示了区域特异性模式，因此后叶中有更多的泽布林II阳性细胞，前叶13中较少。这也与区域独特的生理功能相关，因为泽布林II负普金耶细胞显示更高的补品发射频率比Purkinje细胞是泽布林II阳性14。
除了小脑皮层外，小脑还包括作为小脑主要输出的深小脑核（DCN）。核由中间体 （MN）、插话 （IN） 和横向核 （LN） 组成。功能成像和患者研究表明，DCN也参与各种行为15，但很少有研究检查基因表达变化在DCN。
分子技术的进步使得评估大脑中的区域基因表达成为可能，并发现了生理学和疾病状态16中不同大脑区域的异质性。这种研究暗示小脑不同于其他大脑区域。例如，与其他大脑区域1相比，小脑中神经元与胶质细胞的比例是倒置的。即使在正常的生理条件下，与17个大脑区域相比，小脑中宣炎基因的表达也受到调节。分子技术在确定导致小脑疾病发病机制的途径方面也非常有用。例如，整个小脑提取物的RNA测序发现，与野生类型对照相比，在Purkinje细胞特异性转基因小鼠模型中，脊柱细胞1型（SCA1）中改变了基因。这些证据揭示了小脑Purkinje细胞中潜在的主要分子通路，并有助于确定潜在的治疗目标18。然而，最近的研究表明，小脑区域11、12、19的易患疾病的易患性存在差异。这可能表明，在不同的小脑区域发生了关键变化，这些变化可能被整个小脑提取物掩盖或未被发现。因此，有必要开发技术，使研究人员能够检查不同小脑区域的分子特征。
这里提出的技术描述了一种可重复的方法来解剖小鼠小脑的四个不同区域，以便将RNA与这些区域分离出来，并探索基因表达的区域差异。 图1A 中鼠标小脑的示意图突出了蓝色和黄色半球的真语。具体来说， 这种技术使得分离四个区域成为可能：深小脑核（DCN）（ 图1A中的红点盒），前紫杉（CCaV）的丘脑皮层（深蓝色） 图1A），后体的丘脑皮层（CCpV）（ 图1A中的浅蓝色）和半球的小脑皮层（图 1A中的黄色）。通过分别评估这些区域的基因表达，将有可能研究这些不同区域独立功能背后的分子机制，以及它们在疾病中的脆弱性的潜在差异。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的方法使得评估四个不同的小脑区域内的基本基因表达和分子机制成为可能 – 深小脑核 （DCN）、前小脑皮层 （CCaV）、后脑脊柱皮层 （CCpV） 和半球小脑皮层 （CCH）。单独评估这些区域的能力将扩大我们对特定小脑区域异质性的了解，并可能揭示它们对各种行为的贡献。
通过下垂分割整个脑组织，可以很容易地可视化和识别小脑的这四个区域，从而允许快速解剖。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Cvetanovic实验室的奥斯汀·费罗和朱奥-吉尔赫姆·罗莎在故障排除解剖、RNA提取和RTqPCR方面提供帮助。这项研究由M.Cvetanovic，R01 NS197387资助;HHS |国家卫生研究院。
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
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