ניתוח אזורי של Cerebellar לניתוח מולקולרי
Summary
אזורים מוחיים שונים כבר מעורבים לשחק תפקיד תפוקות התנהגותיות ברורות, עדיין המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין לא ידוע. עבודה זו מתארת שיטה להתרבות במהירות ולנתח קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור, האזורים הקדמיים והאחוריים של ורמיס, ואת גרעיני המוח הקטן העמוקים על מנת לחקור הבדלים מולקולריים על ידי בידוד RNA ובדיקת הבדלים בביטוי הגנים.
Abstract
Cerebellum ממלא תפקיד חשוב במספר פונקציות מפתח כולל שליטה בתנועה, איזון, קוגניציה, תגמול, השפעה. מחקרי הדמיה מצביעים על כך שאזורים מוחיים נפרדים תורמים לפונקציות שונות אלה. מחקרים מולקולריים הבוחנים הבדלים במוח הקטן האזורי מפגרים כפי שהם נעשים בעיקר על תמציות מוחין שלמות ובכך להסוות כל הבחנות על פני אזורים מוחיים ספציפיים. כאן אנו מתארים טכניקה לשחזור ובמהירות של ארבעה אזורי מוח הקטן שונים: גרעיני המוח הקטן העמוקים (DCN), קליפת המוח המוח הקדמית והאחורית, קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור. ניתוח אזורים נפרדים אלה מאפשר לחקור מנגנונים מולקולריים שעשויים לעמוד בבסיס תרומתם הייחודית לאיזון, תנועה, השפעה וקוגניציה. טכניקה זו עשויה לשמש גם כדי לחקור הבדלים ברגישות הפתולוגית של אזורים ספציפיים אלה על פני מודלים שונים של מחלות עכבר.
Introduction
המוח הקטן מכיל יותר ממחצית הנוירונים במוח, מבחינה היסטורית המכונה מרכז שליטה ואיזון מוטורי במוח1. לאחרונה, מחקרים הראו כי המוח הקטן ממלא תפקיד מפתח בפונקציות שונות אחרות, כולל קוגניציה, עיבוד תגמול, ולהשפיעעל 2,3,4,5.
המוח הקטן יש אנטומיה המתוארת היטב: אזור קליפת המוח מורכב גרגר, Purkinje, ושכבות מולקולריות. תאי גרגר יוצרים את שכבת תא הגרגר ושולחים קלט באמצעות סיבים מקבילים לדנדריטים של תאי Purkinje של השכבה המולקולרית אשר מקבלים גם קלט מסיבי טיפוס שמקורם בזית נחות. תאי Purkinje לשלוח תחזיות מעכבות לתאים גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN), אשר משמש את הפלט העיקרי מן המוח הקטן. הפלט של מעגל המוח הקטן הזה מווסת עוד יותר על ידי הפעילות של interneurons מעכב בקליפת המוח הקטן, כולל Golgi, stellate, ותאי סל4. יחידה תפקודית מוחית זו מופצת בכל האונים של קליפת המוח הקטן. למרות מעגלים אחידים יחסית זה על פני המוח הקטן, עדויות מספרות דימות מוחי אנושי ומחקרים סבלניים מצביעים על הטרוגניות תפקודית של המוח הקטן6,7.
קליפת המוח הקטן יכולה להיות מחולקת לשני אזורים עיקריים: ורמיס המוגדר על קו האמצע, וחצי הכדור לרוחב. ניתן לחלק את הוורמוי עוד יותר לאופות הקדמיות והאחוריות. אזורים נפרדים אלה של המוח הקטן היו מעורבים בתרומה להתנהגויות שונות. דפוסי פעילות מעוררי משימות או נטולי משימות סיבכו את העובדה שאזורים הקדמיים של הוורמיס תורמים יותר לתפקוד המוטורי בעוד שהרמיס האחורי תורם יותר לקוגניציה6,7. ורמיס מקושר גם עם השפעה ורגשות, בעוד חצי הכדור המוחי לתרום מנהל, חזותי-מרחבי, שפה, ופונקציות mnemonic אחרים8. בנוסף, מחקרים אנטומיים סיפקו ראיות לכך שאזורי המוח הקטן הייחודיים מבחינה תפקודית מחוברים לאזורים קליפתיים שונים9. מיפוי תסמיני נגע גילה כי חולים עם שבץ המשפיעים על lobules הקדמי (מתרחב לתוך lobule VI) היו ביצועים ירודים יותר על משימות מוטוריות עדינות, בעוד חולים עם נזק לאזורי האונה האחורית וחצי הכדורים הראו ליקויים קוגניטיביים בהיעדר תסמונת מוטורית מוחית10. לבסוף, פתולוגיה מוחית אזורית במחלה מצביעה על כך שאזורי המוח הקטן הייחודיים מבחינה תפקודית רגישים גם הם באופן שונה למחלה11,12.
בעוד הרבה פחות נחקר, ראיות ראשוניות מדגים חתימות ביטוי גנים ברורים על פני אזורים קליפת המוח הקטן. ביטוי התא Purkinje של Zebrin II מראה דפוס ספציפי לאזור vermis, כך שיש יותר תאים חיוביים Zebrin II ב lobules האחוריים ופחות ב lobules הקדמי13. זה גם מתואם עם תפקוד פיזיולוגי ייחודי אזורי כמו תאי Purkinje שלילי זברין II להציג תדירות גבוהה יותר של ירי טוניק מאשר תאי Purkinje כי הם זברין II חיובי14.
בנוסף קליפת המוח הקטן, המוח הקטן כולל גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN) המשמשים את הפלט העיקרי עבור המוח הקטן. הגרעינים מורכבים מהמידל (MN), משולבים (IN) וגרעיני לרוחב (LN). הדמיה פונקציונלית ומחקרי מטופלים הראו כי DCN גם להשתתף בהתנהגויות שונות15, אבל מעט מאוד מחקרים לבחון שינוי ביטוי גנים ב- DCN.
ההתקדמות בטכניקות מולקולריות אפשרה להעריך ביטוי גנים אזורי במוח וחשפו הטרוגניות על פני ובתוך אזורי מוח שונים הן במצבים פיזיולוגיים והן במצבי מחלה16. מחקרים כאלה מסבכים כי המוח הקטן שונה מאזורי מוח אחרים. לדוגמה, היחס בין נוירונים לתאי גליה הפוך במוח הקטן בהשוואה לאזורי מוח אחרים1. אפילו בתנאים פיזיולוגיים רגילים, הביטוי של גנים פרו-דליקים הוא upregulated במוח הקטן לעומת אזורי המוחהאחרים 17. טכניקות מולקולריות היו גם מאוד שימושי בזיהוי המסלולים התורמים פתוגנזה של מחלות מוחיות. לדוגמה, רצף RNA של כל תמציות המוח הקטן זיהה גנים שהשתנו במודל עכבר מהונדס ספציפי לתא Purkinje של spinocerebellar אטקסיה סוג 1 (SCA1) בהשוואה לבקרות סוג הבר שלהם. ראיות כאלה חשפו מסלולים מולקולריים מרכזיים שבבסיס פתוגנזה בתאי פורקיניה במוח הקטן ועזרו לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות18. עם זאת, מחקרים אחרונים מראים כי ישנם הבדלים בפגיעות למחלות ברחבי אזורי המוח הקטן11,12,19. זה יכול להצביע על כך שיש שינויים מרכזיים המתרחשים באזורים מוחיים נפרדים, אשר עשוי להיות רעול פנים או מבלי שיבחינו עם תמציות מוחין שלם. לכן, יש צורך לפתח טכניקות המאפשרות לחוקרים לבחון פרופילים מולקולריים באזורים מוחיים שונים.
הטכניקה המוצעת כאן מתארת שיטה ניתנת לשחזור לנתח ארבעה אזורים נפרדים של המוח הקטן של העכבר על מנת לבודד RNA מאזורים אלה ולחקור הבדלים אזוריים בביטוי גנים. השרטוט של המוח הקטן של העכבר באיור 1A מדגיש את הוורמיס בכחול, ואת ההמיספרות בצהוב. באופן ספציפי, טכניקה זו מאפשרת לבודד ארבעה אזורים: גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN) (תיבות מנוקדות באדום באיור 1A),קליפת המוח הקטן של ורמיס הקדמי (CCaV) (כחול כהה באיור 1A), קליפת המוח המוח של ורמיס האחורי (CCpV) (כחול בהיר באיור 1A),וקליפת המוח הקטן של האונה הקדמית (CCH) (צהוב באיור 1A). על ידי הערכת ביטוי גנים של אזורים אלה בנפרד, ניתן יהיה לחקור מנגנונים מולקולריים שבביסת פונקציות נפרדות של אזורים שונים אלה, כמו גם הבדלים פוטנציאליים בפגיעותם במחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשרת להעריך את ביטוי הגנים הבסיסיים ואת המנגנונים המולקולריים בארבעה אזורי מוח הקטן נפרדים – גרעיני המוח הקטן העמוקים (DCN), קליפת המוח הקדמית של ורמיס (CCaV), קליפת המוח המוח האחורית של הוורמיס (CCPV), ואת קליפת המוח הקטן של חצי הכדור (CCH). היכולת להעריך אזורים אלה בנפרד תרחיב ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאוסטין פרו וג’ואאו-גילהרמה רוזה במעבדת Cvetanovic על עזרתם בפתרון בעיות ניתוחים ובחילוץ RNA ו- RTqPCR. מחקר זה ממומן על ידי מ’סבטנוביץ’, R01 NS197387; | HHS מכוני בריאות לאומיים (NIH).
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region – dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. . From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , (2020).
