Dissection régionale cérébelleuse pour l’analyse moléculaire
Summary
Différentes régions cérébelleuses ont été impliquées pour jouer un rôle dans des résultats comportementaux distincts, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents restent inconnus. Ce travail décrit une méthode pour disséquer de manière reproductible et rapide le cortex cérébelleux des hémisphères, les régions antérieures et postérieures du vermis et les noyaux cérébelleux profonds afin de sonder les différences moléculaires en isolant l’ARN et en testant les différences dans l’expression des gènes.
Abstract
Le cervelet joue un rôle important dans plusieurs fonctions clés, notamment le contrôle du mouvement, de l’équilibre, de la cognition, de la récompense et de l’affect. Les études d’imagerie indiquent que des régions cérébelleuses distinctes contribuent à ces différentes fonctions. Les études moléculaires examinant les différences cérébelleuses régionales sont à la traîne car elles sont principalement effectuées sur des extraits cérébelleux entiers, masquant ainsi toute distinction entre des régions cérébelleuses spécifiques. Nous décrivons ici une technique permettant de disséquer de manière reproductible et rapide quatre régions cérébelleuses différentes : les noyaux cérébelleux profonds (DCN), le cortex cérébelleux vermal antérieur et postérieur et le cortex cérébelleux des hémisphères. La dissection de ces régions distinctes permet d’explorer les mécanismes moléculaires qui peuvent sous-tendre leurs contributions uniques à l’équilibre, au mouvement, à l’affect et à la cognition. Cette technique peut également être utilisée pour explorer les différences de susceptibilité pathologique de ces régions spécifiques à travers divers modèles de maladies de souris.
Introduction
Le cervelet contient plus de la moitié des neurones dans le cerveau et a toujours été appelé un centre de contrôle moteur et d’équilibre dans le cerveau1. Plus récemment, des études ont démontré que le cervelet joue un rôle clé dans diverses autres fonctions, y compris la cognition, le traitement de la récompense etl’affect2,3,4,5.
Le cervelet a une anatomie bien décrite: la région du cortex est composée de granules, de Purkinje et de couches moléculaires. Les cellules granulaires forment la couche cellulaire granulaire et envoient des entrées via des fibres parallèles aux dendrites cellulaires de Purkinje de la couche moléculaire qui reçoivent également l’entrée des fibres grimpantes provenant de l’olive inférieure. Les cellules de Purkinje envoient des projections inhibitrices aux cellules des noyaux cérébelleux profonds (DCN), qui servent de sortie principale du cervelet. La sortie de ce circuit cérébelleux est en outre modulée par l’activité des interneurones inhibiteurs dans le cortex cérébelleux, y compris les cellules de Golgi, stellaires etpaniers 4. Cette unité fonctionnelle cérébelleuse est répartie dans tous les lobules du cortex cérébelleux. Malgré ce circuit relativement uniforme à travers le cervelet, les preuves de la littérature de neuroimagerie humaine et des études de patients indiquent une hétérogénéité fonctionnelle du cervelet6,7.
Le cortex cérébelleux peut être divisé en deux régions principales: le vermis défini par la ligne médiane et les hémisphères latéraux. Le vermis peut être divisé en lobules antérieurs et postérieurs. Ces régions distinctes du cervelet ont été impliquées dans la contribution à différents comportements. Les modèles d’activité évoqués par une tâche ou sans tâche impliquaient que les régions antérieures du vermis contribuent davantage à la fonction motrice tandis que le vermis postérieur contribue davantage à la cognition6,7. Le vermis est également lié à l’affect et aux émotions, tandis que les hémisphères cérébelleux contribuent aux fonctions exécutives, visuelles-spatiales, langagiriques et autres fonctions mnémoniques8. En outre, des études anatomiques ont fourni des preuves que des régions cérébelleuses fonctionnellement distinctes sont liées à différentes régions corticales9. La cartographie des lésions-symptômes a révélé que les patients ayant subi un AVC affectant les lobules antérieurs (s’étendant jusqu’au lobule VI) avaient de moins bonnes performances sur les tâches motrices fines, tandis que les patients présentant des lésions des régions du lobe postérieur et des hémisphères présentaient des déficits cognitifs en l’absence de syndrome moteur cérébelleux10. Enfin, la pathologie cérébelleuse régionale dans la maladie indique que les régions cérébelleuses fonctionnellement distinctes sont également différemment sensibles à la maladie11,12.
Bien que beaucoup moins explorées, les preuves préliminaires démontrent des signatures d’expression génique distinctes dans les régions corticales cérébelleuses. L’expression cellulaire de Purkinje de Zebrin II montre un motif spécifique à la région dans le vermis tel qu’il y a plus de cellules positives de Zebrin II dans les lobules postérieurs et moins dans les lobules antérieurs13. Ceci est également en corrélation avec la fonction physiologique régionalement distincte car les cellules de Purkinje négatives de Zebrin II présentent une fréquence de déclenchement tonique plus élevée que les cellules de Purkinje qui sont Zebrin II positives14.
En plus du cortex cérébelleux, le cervelet comprend les noyaux cérébelleux profonds (DCN) qui servent de sortie primaire pour le cervelet. Les noyaux sont constitués des noyaux médiaux (MN), interposés (IN) et latéraux (LN). L’imagerie fonctionnelle et les études sur les patients ont démontré que le DCN participe également à divers comportements15, mais très peu d’études examinent le changement d’expression génique dans le DCN.
Les progrès des techniques moléculaires ont permis d’évaluer l’expression génique régionale dans le cerveau et ont révélé une hétérogénéité entre et au sein de différentes régions du cerveau dans les états physiologiques et pathologiques16. De telles études impliquent que le cervelet est différent des autres régions du cerveau. Par exemple, le rapport des neurones aux cellules gliales est inversé dans le cervelet par rapport à d’autres régions du cerveau1. Même dans des conditions physiologiques normales, l’expression des gènes pro-inflammatoires est régulée à la hausse dans le cervelet par rapport aux autres régions du cerveau17. Les techniques moléculaires ont également été très utiles pour identifier les voies qui contribuent à la pathogenèse des maladies cérébelleuses. Par exemple, le séquençage de l’ARN de l’ensemble des extraits cérébelleux a identifié des gènes modifiés dans un modèle murin transgénique spécifique à la cellule de Purkinje de l’ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) par rapport à leurs témoins de type sauvage. De telles preuves ont révélé des voies moléculaires clés sous-jacentes à la pathogenèse dans les cellules cérébelleuses de Purkinje et ont aidé à identifier des cibles thérapeutiques potentielles18. Cependant, des études récentes suggèrent qu’il existe des différences dans la vulnérabilité aux maladies dans les régions cérébelleuses11,12,19. Cela pourrait indiquer qu’il y a des changements clés qui se produisent dans des régions cérébelleuses distinctes, qui peuvent être masquées ou non détectées avec des extraits cérébelleux entiers. Il est donc nécessaire de développer des techniques qui permettent aux chercheurs d’examiner les profils moléculaires dans différentes régions cérébelleuses.
La technique proposée ici décrit une méthode reproductible pour disséquer quatre régions distinctes du cervelet de la souris afin d’isoler l’ARN de ces régions et d’explorer les différences régionales dans l’expression des gènes. Le schéma du cervelet de la souris sur la figure 1A met en évidence le vermis en bleu et les hémisphères en jaune. Concrètement, cette technique permet d’isoler quatre régions : les noyaux cérébelleux profonds (DCN) (cases pointillées rouges sur la figure 1A),le cortex cérébelleux du vermis antérieur (CCaV) (bleu foncé sur la figure 1A),le cortex cérébelleux du vermis postérieur (CCpV) (bleu clair sur la figure 1A),et le cortex cérébelleux des hémisphères (CCH) (jaune sur la figure 1A). En évaluant séparément l’expression génique de ces régions, il sera possible d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux fonctions discrètes de ces différentes régions ainsi que les différences potentielles dans leur vulnérabilité à la maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici permet d’évaluer l’expression génique sous-jacente et les mécanismes moléculaires au sein de quatre régions cérébelleuses distinctes – les noyaux cérébelleux profonds (DCN), le cortex cérébelleux antérieur du vermis (CCaV), le cortex cérébelleux postérieur du vermis (CCpV) et le cortex cérébelleux des hémisphères (CCH). La capacité d’évaluer ces régions séparément élargira nos connaissances sur l’hétérogénéité de régions cérébelleuses spécifiques et peu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Austin Ferro et Juao-Guilherme Rosa du laboratoire Cvetanovic pour leur aide dans le dépannage des dissections et dans l’extraction de l’ARN et la RTqPCR. Cette recherche est financée par M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS National Institutes of Health (NIH).
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region – dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. . From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , (2020).
