Региональное рассечение мозжечка для молекулярного анализа
Summary
Различные мозжечковые области были замешаны в том, чтобы играть роль в различных поведенческих выходах, но основные молекулярные механизмы остаются неизвестными. В этой работе описывается метод воспроизводимого и быстрого рассечения коры мозжечка полушарий, передней и задней областей вермиса и глубоких ядер мозжечка с целью исследования молекулярных различий путем выделения РНК и тестирования различий в экспрессии генов.
Abstract
Мозжечок играет важную роль в нескольких ключевых функциях, включая контроль движения, равновесия, познания, вознаграждения и аффекта. Исследования изображений показывают, что различные мозжечковые области способствуют этим различным функциям. Молекулярные исследования, изучающие региональные различия мозжечка, отстают, поскольку они в основном проводятся на целых экстрактах мозжечка, тем самым маскируя любые различия в конкретных мозжечковых областях. Здесь мы описываем технику воспроизводимого и быстрого рассечения четырех различных мозжечковых областей: глубоких ядер мозжечка (DCN), передней и задней вермальной мозжечковой коры и мозжечковой коры полушарий. Анализ этих различных областей позволяет исследовать молекулярные механизмы, которые могут лежать в основе их уникального вклада в баланс, движение, аффект и познание. Этот метод также может быть использован для изучения различий в патологической восприимчивости этих конкретных областей в различных моделях заболеваний мышей.
Introduction
Мозжечок содержит более половины нейронов в мозге и исторически упоминается как центр управления и равновесия в мозге1. Совсем недавно исследования показали, что мозжечок играет ключевую роль в различных других функциях, включая познание, обработку вознаграждения и влияние2,3,4,5.
Мозжечок имеет хорошо описанную анатомию: область коры состоит из гранул, Пуркинье и молекулярных слоев. Грануляные клетки образуют грануляный клеточный слой и посылают вход через параллельные волокна в клеточные дендриты Пуркинье молекулярного слоя, которые также получают входные данные от вьющихся волокон, возникших в нижней оливе. Клетки Пуркинье посылают ингибирующие проекции клеткам в глубоких мозжечковых ядрах (DCN), которые служат основным выходом из мозжечка. Выход этого мозжечкового контура дополнительно модулируется активностью ингибирующих интернейронов в коре мозжечка, включая гольджи, звездчатые и корзинчатые клетки4. Этот мозжечковой функциональный блок распределен по всем долочкам коры мозжечка. Несмотря на эту относительно однородную схему по всему мозжечку, данные из литературы по нейровизуализации человека и исследований пациентов указывают на функциональную гетерогенность мозжечка6,7.
Кору мозжечка можно разделить на две основные области: среднюю, определенную вермисом, и боковые полушария. Вермис можно далее разделить на переднюю и заднюю дольки. Эти различные области мозжечка были причастны к содействию различному поведению. Паттерны активности, вызванные задачами или без задач, связаны с тем, что передние области вермиса вносят больший вклад в двигательную функцию, в то время как задние вермисы вносят больший вклад в познание6,7. Вермис также связан с аффектами и эмоциями, в то время как полушария мозжечка способствуют исполнительным, визуально-пространственным, языковым и другим мнемоническим функциям8. Кроме того, анатомические исследования предоставили доказательства того, что функционально различные мозжечковые области связаны с различными областями коры9. Картирование симптомов поражения показало, что пациенты с инсультами, затрагивающими передние дольки (распространяющиеся в дольку VI), имели более низкую производительность при выполнении мелкомоторных задач, в то время как пациенты с повреждением областей задней доли и полушарий демонстрировали когнитивный дефицит при отсутствии мозжечкового моторного синдрома10. Наконец, регионарная мозжечковая патология при заболевании указывает на то, что функционально различные мозжечковые области также по-разному восприимчивы к заболеванию11,12.
Хотя предварительные данные гораздо менее изучены, они демонстрируют различные сигнатуры экспрессии генов в мозжечковых корковых областях. Экспрессия клеток Пуркинье Зебрина II показывает специфическую для области структуру в вермисе, так что в задних дочках больше положительных клеток Зебрина II и меньше в передних долеках13. Это также коррелирует с регионально отличной физиологической функцией, поскольку отрицательные клетки Зебрина II Пуркинье демонстрируют более высокую частоту тонического возбуждения, чем клетки Пуркинье, которые являются положительными Зебрином II14.
В дополнение к коре мозжечка, мозжечок включает глубокие мозжечковые ядра (DCN), которые служат основным выходом для мозжечка. Ядра состоят из медиал (MN), интерпозиции (IN) и боковых ядер (LN). Функциональная визуализация и исследования пациентов продемонстрировали, что DCN также участвует в различных поведенческих действиях15,но очень немногие исследования изучают изменение экспрессии генов в DCN.
Достижения в области молекулярных методов позволили оценить региональную экспрессию генов в мозге и выявили гетерогенность между и внутри различных областей мозга как в физиологическом, так и в заболевании состояний16. Такие исследования показывают, что мозжечок отличается от других областей мозга. Например, отношение нейронов к глиальным клеткам инвертируется в мозжечке по сравнению с другими областями мозга1. Даже в нормальных физиологических условиях экспрессия провоспалительных генов повышается в мозжечке по сравнению с другими областями мозга17. Молекулярные методы также были очень полезны для выявления путей, которые способствуют патогенезу мозжечковых заболеваний. Например, секвенирование РНК всех экстрактов мозжечка идентифицировало гены, измененные в специфической для клетки Пуркинье трансгенной мышиной модели спиноцеребеллярной атаксии типа 1 (SCA1) по сравнению с их контролем дикого типа. Такие данные выявили ключевые молекулярные пути, лежащие в основе патогенеза в мозжечковых клетках Пуркинье, и помогли идентифицировать потенциальные терапевтические мишени18. Однако последние исследования показывают, что существуют различия в уязвимости к заболеваниям в мозжечковых областях11,12,19. Это может указывать на то, что существуют ключевые изменения, происходящие в различных мозжечковых областях, которые могут быть замаскированы или незамечены целыми экстрактами мозжечка. Таким образом, существует необходимость в разработке методов, которые позволят исследователям изучать молекулярные профили в различных мозжечковых областях.
Предлагаемый здесь метод описывает воспроизводимый метод рассечения четырех различных областей мозжечка мыши, чтобы изолировать РНК из этих областей и исследовать региональные различия в экспрессии генов. Схема мозжечка мыши на рисунке 1А выделяет вермис синим цветом, а полушария желтым. В частности, этот метод позволяет выделить четыре области: глубокие ядра мозжечка (DCN) (красные пунктирные коробки на рисунке 1A),мозжечковая кора передней вермисы (CCaV) (темно-синий на рисунке 1A),мозжечковая кора задней вермисы (CCpV) (светло-синяя на рисунке 1A)и мозжечковая кора полушарий (CCH) (желтый на рисунке 1A). Оценивая экспрессию генов этих областей отдельно, можно будет исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе дискретных функций этих различных областей, а также потенциальные различия в их уязвимости при заболевании.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь, позволяет оценить экспрессию основных генов и молекулярные механизмы в четырех различных мозжечковых областях – глубоких ядрах мозжечка (DCN), передней мозжечковой коре вермиса (CCaV), задней мозжечковой коре вермиса (CCpV) и коре мозжечка полушарий (CCH). Возможность оц?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Остину Ферро и Жуао-Гильерме Розе в лаборатории Цветановича за их помощь в устранении неполадок вскрытий и в экстракции РНК и RTqPCR. Данное исследование финансируется М. Цветановичем, R01 NS197387; | HHS Национальные институты здравоохранения (NIH).
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region – dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. . From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , (2020).
