分子解析のための小脳局所解剖
Summary
異なる小脳領域は、異なる行動出力に役割を果たすのに関与してきましたが、根本的な分子メカニズムは不明のままです。本研究では、RNAを単離し、遺伝子発現の違いを検査することによって分子の違いを探るために、半球の小脳皮質、前部および後部の小脳部、および深い小脳核を再現的かつ迅速に解剖する方法を説明する。
Abstract
小脳は、動きの制御を含むいくつかの重要な機能で重要な役割を果たしています, バランス, 認知, 報酬, そして、影響.イメージング研究は、異なる小脳領域がこれらの異なる機能に寄与することを示している。局所的小脳の違いを調べる分子研究は、主に小脳エキス全体で行われるため、特定の小脳領域にわたる区別を隠すため、遅れている。ここでは、深い小脳核(DCN)、前および後の脊髄小脳皮質、半球の小脳皮質の4つの異なる小脳領域を再現し、迅速に解剖する技術について説明します。これらの異なる領域を解剖することは、バランス、動き、影響および認知への彼らのユニークな貢献の根源となり得る分子メカニズムの探求を可能にする。この技術はまた、様々なマウス疾患モデルにおけるこれらの特定領域の病理学的感受性の違いを探求するために使用され得る。
Introduction
小脳は脳内のニューロンの半分以上を含み、歴史的に脳内の運動制御とバランスセンターと呼ばれています1.最近では、小脳が認知、報酬処理、および2、3、4、5に影響を及ぼすなど、他のさまざまな機能において重要な役割を果たしていることを実証した。
小脳は、よく記述された解剖学を有する:皮質領域は顆粒、プルキンジェ、および分子層で構成される。顆粒細胞は、顆粒細胞層を形成し、分子層のプルキンエ細胞デンドライトに平行繊維を介して入力を送信し、劣ったオリーブに由来する上昇繊維からの入力も受け取る。プルキンエ細胞は、小脳からの主な出力として機能する深小脳核(DCN)内の細胞に抑制性の投影を送る。この小脳回路の出力は、ゴルジ、ステレート、およびバスケット細胞4を含む小脳皮質における阻害性相互作用ニューロンの活性によってさらに変調される。この小脳機能ユニットは、小脳皮質のすべての小葉全体に分布しています。小脳を横切るこの比較的均一な回路にもかかわらず、ヒトの神経イメージング文献および患者研究からの証拠は、小脳6,7の機能的不均一性を示す。
小脳皮質は、正中線定義のめまいと横半球の2つの主要な領域に分けることができます。ベルミはさらに前葉と後部小葉に分けることができます。小脳のこれらの異なる領域は、異なる行動に寄与することに関与している。タスク誘発またはタスクフリーの活動パターンは、脊椎の前領域が運動機能に多く寄与し、後方のバーミが認知に多くを寄与することを含む6、7。バーミは影響や感情とも連動し、小脳半球はエグゼクティブ、視覚空間、言語、その他のニーモニック機能8に寄与する。さらに、解剖学的研究は、機能的に異なる小脳領域が異なる皮質領域と接続しているという証拠を提供した9.病変症状のマッピングは、前葉に影響を与える脳卒中(小葉VIに及ぶ)を有する患者は細かい運動タスクでパフォーマンスが悪く、後葉領域および半球に損傷を与えた患者は小脳運動症候群10の不在時に認知障害を示すことを明らかにした。最後に、疾患における局所小脳病理は、機能的に異なる小脳領域も疾患11,12に対して異なる感受性を示す。
あまり探求されているが、予備的な証拠は、小脳皮質領域全体で明確な遺伝子発現シグネチャを示している。ゼブリンIIのプルキンエ細胞発現は、後葉小葉にゼブリンII陽性細胞が多く、前葉13に少なくなるようなめまいにおける領域特異的なパターニングを示す。これはまた、ゼブリンII陰性プルキンイェ細胞がゼブリンII陽性14であるプルキンエ細胞よりも高いトニック焼成の頻度を示すように、局所的に異なる生理機能と相関する。
小脳は小脳の皮質に加えて、小脳の主要な出力として機能する深い小脳核(DCN)を含む。核は、内側(MN)、介在(IN)、および横核(LN)で構成されています。機能的イメージングおよび患者研究は、DCNが様々な行動15にも関与することを実証しているが、DCNの遺伝子発現変化を調べる研究はほとんどない。
分子技術の進歩により、脳内の領域遺伝子発現を評価することが可能となり、生理学的および疾患状態16の両方において異なる脳領域の異種性を発見した。このような研究は、小脳が他の脳領域とは異なっていることを意味します。例えば、神経細胞とグリア細胞の比率は、他の脳領域1と比較して小脳で反転する。正常な生理学的条件においても、他の脳領域17と比較して小脳において炎症促進性遺伝子の発現がアップレギュレートされる。分子技術は、小脳病の病因に寄与する経路を同定する上でも非常に有用であった。例えば、小脳全体のRNAシーケンシングは、スピノセレラー失調症のプルキンエ細胞特異的トランスジェニックマウスモデルで改変された遺伝子を同定し、その野生型制御と比較した。このような証拠は、小脳プルキンエ細胞における病因の根底にある主要な分子経路を明らかにし、潜在的な治療標的18を同定するのに役立った。しかし、最近の研究では、小脳領域11、12、19の疾患に対する脆弱性に違いがあることを示唆している。これは、異なる小脳領域で重要な変化が起きており、小脳抽出物全体でマスクまたは検出されないことを示している可能性があります。したがって、研究者が異なる小脳領域の分子プロファイルを調べることができるようにする技術を開発する必要があります。
ここで提案される技術は、それらの領域からRNAを分離し、遺伝子発現の地域差を探るためにマウス小脳の4つの異なる領域を解剖する再現可能な方法を記述する。 図1A のマウス小脳の模式図は、青で朱色を、半球を黄色で強調しています。具体的には、この技術は、深い小脳核(DCN)( 図1Aの赤点点のボックス)、前立体(CCaV)の小脳皮質( 図1Aの濃い青色)、後部バーミ(CCpV)の小脳皮質( 図1Aの水色)、および小脳皮質(図 1Aの淡色)の4つの領域を単離することを可能にする。これらの領域の遺伝子発現を個別に評価することにより、これらの異なる領域の離散機能の基礎となる分子メカニズムと、疾患における脆弱性の潜在的な違いを調査することが可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、4つの異なる小脳領域内の基礎となる遺伝子発現および分子メカニズムを評価することを可能にする – 深い小脳核(DCN)、脊椎の前小脳皮質(CCaV)、ベルミの後小脳皮質(CCpV)、および半球の小脳皮質(CCH)。これらの領域を別々に評価する能力は、特定の小脳領域の不均一性に関する我々の知識を拡大し、おそらく様々な行動への貢献に光を当てる。
完全…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
クヴェタノビッチ研究所のオースティン・フェロとジュアオ・ギルヘルメ・ローザは、分節のトラブルシューティングやRNA抽出とRTqPCRに協力してくれたことに感謝しています。この研究はM.クヴェタナノビッチ、R01 NS197387によって資金提供されています。HHS |国立衛生研究所(NIH)。
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region – dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. . From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , (2020).
