Zerebelläre regionale Dissektion für die molekulare Analyse
Summary
Verschiedene Kleinhirnregionen spielen eine Rolle bei unterschiedlichen Verhaltensergebnissen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bleiben unbekannt. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Kleinhirnrinde der Hemisphären, der vorderen und hinteren Regionen der Vermis und der tiefen Kleinhirnkerne reproduzierbar und schnell zu sezieren, um durch Isolierung von RNA und Tests auf Unterschiede in der Genexpression auf molekulare Unterschiede zu untersuchen.
Abstract
Kleinhirn spielt eine wichtige Rolle in mehreren Schlüsselfunktionen, einschließlich der Kontrolle von Bewegung, Gleichgewicht, Kognition, Belohnung und Affekt. Bildgebende Untersuchungen deuten darauf hin, dass unterschiedliche Kleinhirnregionen zu diesen verschiedenen Funktionen beitragen. Molekulare Studien, die regionale Kleinhirnunterschiede untersuchen, hinken hinterher, da sie meist an ganzen Kleinhirnextrakten durchgeführt werden, wodurch alle Unterscheidungen zwischen bestimmten Kleinhirnregionen maskiert werden. Hier beschreiben wir eine Technik, um vier verschiedene Kleinhirnregionen reproduzierbar und schnell zu sezieren: die tiefen Kleinhirnkerne (DCN), die vordere und hintere vermale Kleinhirnrinde und die Kleinhirnrinde der Hemisphären. Die Sezierung dieser unterschiedlichen Regionen ermöglicht die Erforschung molekularer Mechanismen, die ihren einzigartigen Beiträgen zu Gleichgewicht, Bewegung, Affekt und Kognition zugrunde liegen können. Diese Technik kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der pathologischen Anfälligkeit dieser spezifischen Regionen in verschiedenen Mauskrankheitsmodellen zu untersuchen.
Introduction
Das Kleinhirn enthält mehr als die Hälfte der Neuronen im Gehirn und wurde historisch als motorisches Kontroll- und Gleichgewichtszentrum im Gehirn bezeichnet1. In jüngerer Zeit haben Studien gezeigt, dass das Kleinhirn eine Schlüsselrolle bei verschiedenen anderen Funktionen spielt, einschließlich Kognition, Belohnungsverarbeitung undAffekt 2,3,4,5.
Das Kleinhirn hat eine gut beschriebene Anatomie: Die Kortexregion besteht aus Granula, Purkinje und molekularen Schichten. Körnerzellen bilden die Granulatzellschicht und senden den Input über parallele Fasern an die Purkinje-Zelldendriten der Molekülschicht, die auch Input von Kletterfasern erhalten, die aus der unteren Olive stammen. Purkinje-Zellen senden hemmende Projektionen an Zellen in den tiefen Kleinhirnkernen (DCN), die als Hauptausgang des Kleinhirns dienen. Die Ausgabe dieses Kleinhirnkreislaufs wird durch die Aktivität der inhibitorischen Interneuronen in der Kleinhirnrinde, einschließlich Golgi-, Stern- und Korbzellen, weiter moduliert4. Diese kleinhirnförmige Funktionseinheit ist über alle Läppchen der Kleinhirnrinde verteilt. Trotz dieser relativ einheitlichen Schaltkreise über das Kleinhirn deuten Beweise aus der Human-Neuroimaging-Literatur und Patientenstudien auf eine funktionelle Heterogenität des Kleinhirnshin 6,7.
Die Kleinhirnrinde kann in zwei Hauptregionen unterteilt werden: die mittelliniendefinierte Vermis und die laterale Hemisphäre. Die Vermis kann weiter in vordere und hintere Läppchen unterteilt werden. Diese unterschiedlichen Regionen des Kleinhirns wurden in die Lage verwickelt, zu unterschiedlichen Verhaltensweisen beizutragen. Aufgaben-evozierte oder aufgabenfreie Aktivitätsmuster implizieren, dass vordere Regionen der Vermis mehr zur motorischen Funktion beitragen, während hintere Vermis mehr zur Kognition beitragen6,7. Die Vermis ist auch mit Affekt und Emotionen verbunden, während Kleinhirnhemisphären zu exekutiven, visuell-räumlichen, sprachlichen und anderen mnemonischen Funktionen beitragen8. Darüber hinaus lieferten anatomische Studien Hinweise darauf, dass funktionell unterschiedliche Kleinhirnregionen mit verschiedenen kortikalen Regionen verbunden sind9. Die Kartierung der Läsionssymptome ergab, dass Patienten mit Schlaganfällen, die die vorderen Läppchen betrafen (bis in das Läppchen VI hinein), eine schlechtere Leistung bei feinmotorischen Aufgaben zeigten, während Patienten mit Schäden an den hinteren Lappenregionen und Hemisphären kognitive Defizite in Abwesenheit des kleinhirnmotorischen Syndromsaufwiesen 10. Schließlich zeigt die regionale Kleinhirnpathologie bei Krankheiten, dass funktionell unterschiedliche Kleinhirnregionen auch unterschiedlich anfällig für Krankheiten sind11,12.
Obwohl viel weniger erforscht, zeigen vorläufige Beweise unterschiedliche Genexpressionssignaturen über zerebelläre kortikale Regionen hinweg. Die Purkinje-Zellexpression von Zebrin II zeigt eine regionsspezifische Musterung in der Vermis, so dass es mehr Zebrin II-positive Zellen in den hinteren Läppchen und weniger in den vorderen Läppchen gibt13. Dies korreliert auch mit einer regional unterschiedlichen physiologischen Funktion, da Zebrin II-negative Purkinje-Zellen eine höhere Frequenz des tonischen Feuerns aufweisen als Purkinje-Zellen, die Zebrin II-positiv sind14.
Neben der Kleinhirnrinde umfasst das Kleinhirn die tiefen Kleinhirnkerne (DCN), die als Primärausgang für das Kleinhirn dienen. Die Kerne bestehen aus den medialen (MN), interposierten (IN) und lateralen Kernen (LN). Funktionelle Bildgebung und Patientenstudien haben gezeigt, dass das DCN auch an verschiedenen Verhaltensweisen beteiligt ist15, aber nur sehr wenige Studien untersuchen die Veränderung der Genexpression in DCN.
Fortschritte in molekularen Techniken haben es ermöglicht, die regionale Genexpression im Gehirn zu beurteilen und haben Heterogenität zwischen und innerhalb verschiedener Gehirnregionen sowohl in physiologischen als auch in Krankheitszuständen aufgedeckt16. Solche Studien implizieren, dass sich das Kleinhirn von anderen Gehirnregionen unterscheidet. Zum Beispiel ist das Verhältnis von Neuronen zu Gliazellen im Kleinhirn im Vergleich zu anderen Hirnregionen invertiert1. Selbst unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Expression von proinflammatorischen Genen im Kleinhirn im Vergleich zu den anderen Hirnregionen hochreguliert17. Molekulare Techniken waren auch sehr nützlich bei der Identifizierung der Wege, die zur Pathogenese von Kleinhirnerkrankungen beitragen. Zum Beispiel identifizierte die RNA-Sequenzierung der gesamten Kleinhirnextrakte Gene, die in einem Purkinje-zellspezifischen transgenen Mausmodell der spinozerebellären Ataxie Typ 1 (SCA1) im Vergleich zu ihren Wildtypkontrollen verändert wurden. Solche Beweise haben wichtige molekulare Wege aufgedeckt, die der Pathogenese in kleinhirnen Purkinje-Zellen zugrunde liegen, und haben dazu beigetragen, potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren18. Neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass es Unterschiede in der Anfälligkeit für Krankheiten in den Kleinhirnregionen gibt11,12,19. Dies könnte darauf hindeuten, dass es in verschiedenen Kleinhirnregionen zu wichtigen Veränderungen kommt, die mit ganzen Kleinhirnextrakten maskiert oder unentdeckt sein können. Daher müssen Techniken entwickelt werden, die es Forschern ermöglichen, molekulare Profile in verschiedenen Kleinhirnregionen zu untersuchen.
Die hier vorgeschlagene Technik beschreibt eine reproduzierbare Methode, um vier verschiedene Regionen des Kleinhirns der Maus zu sezieren, um RNA aus diesen Regionen zu isolieren und regionale Unterschiede in der Genexpression zu untersuchen. Das Schema des Kleinhirns der Maus in Abbildung 1A hebt die Vermis in Blau und die Hemisphären in Gelb hervor. Insbesondere ermöglicht diese Technik die Isolierung von vier Regionen: tiefe Kleinhirnkerne (DCN) (rot gepunktete Kästchen in Abbildung 1A),die Kleinhirnrinde der vorderen Vermis (CCaV) (dunkelblau in Abbildung 1A),die Kleinhirnrinde der hinteren Vermis (CCpV) (hellblau in Abbildung 1A)und die Kleinhirnrinde der Hemisphären (CCH) (gelb in Abbildung 1A). Durch die getrennte Beurteilung der Genexpression dieser Regionen wird es möglich sein, molekulare Mechanismen zu untersuchen, die den diskreten Funktionen dieser verschiedenen Regionen zugrunde liegen, sowie mögliche Unterschiede in ihrer Anfälligkeit für Krankheiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, die zugrunde liegende Genexpression und molekularen Mechanismen innerhalb von vier verschiedenen Kleinhirnregionen zu beurteilen – den tiefen Kleinhirnkernen (DCN), der vorderen Kleinhirnrinde der Vermis (CCaV), der hinteren Kleinhirnrinde der Vermis (CCpV) und der Kleinhirnrinde der Hemisphären (CCH). Die Fähigkeit, diese Regionen separat zu bewerten, wird unser Wissen über die Heterogenität bestimmter Kleinhirnregionen erweitern und möglicherweise ihren Beitrag zu ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Austin Ferro und Juao-Guilherme Rosa im Cvetanovic-Labor für ihre Hilfe bei der Fehlerbehebung bei Dissektionen und bei der RNA-Extraktion und RTqPCR. Diese Forschung wird gefördert von M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Nationale Institute für Gesundheit (NIH).
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region – dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. . From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , (2020).
