Dissezione regionale cerebellare per l'analisi molecolare
Summary
Diverse regioni cerebellari sono state implicate per svolgere un ruolo in distinti output comportamentali, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. Questo lavoro descrive un metodo per sezionare in modo riproducibile e rapido la corteccia cerebellare degli emisferi, delle regioni anteriori e posteriori del verme e dei nuclei cerebellari profondi al fine di sondare le differenze molecolari isolando l’RNA e testando le differenze nell’espressione genica.
Abstract
Il cervelletto svolge un ruolo importante in diverse funzioni chiave tra cui il controllo del movimento, l’equilibrio, la cognizione, la ricompensa e l’affetto. Studi di imaging indicano che regioni cerebellari distinte contribuiscono a queste diverse funzioni. Gli studi molecolari che esaminano le differenze cerebellari regionali sono in ritardo in quanto sono per lo più eseguiti su estratti cerebellari interi, mascherando così qualsiasi distinzione tra specifiche regioni cerebellari. Qui descriviamo una tecnica per sezionare in modo riproducibile e rapido quattro diverse regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare vermale anteriore e posteriore e la corteccia cerebellare degli emisferi. Sezionare queste regioni distinte consente l’esplorazione di meccanismi molecolari che possono essere alla base dei loro contributi unici all’equilibrio, al movimento, all’affetto e alla cognizione. Questa tecnica può anche essere utilizzata per esplorare le differenze nella suscettibilità patologica di queste regioni specifiche in vari modelli di malattia murina.
Introduction
Il cervelletto contiene oltre la metà dei neuroni nel cervello ed è stato storicamente indicato come un centro di controllo motorio e di equilibrio nel cervello1. Più recentemente, gli studi hanno dimostrato che il cervelletto svolge un ruolo chiave in varie altre funzioni tra cui la cognizione, l’elaborazione della ricompensa e l’influenza2,3,4,5.
Il cervelletto ha un’anatomia ben descritta: la regione della corteccia è composta da granuli, Purkinje e strati molecolari. Le cellule del granulo formano lo strato cellulare del granulo e inviano input tramite fibre parallele ai dendriti della cellula di Purkinje dello strato molecolare che ricevono anche input da fibre rampicanti che hanno avuto origine nell’oliva inferiore. Le cellule di Purkinje inviano proiezioni inibitorie alle cellule nei nuclei cerebellari profondi (DCN), che funge da output principale dal cervelletto. L’uscita di questo circuito cerebellare è ulteriormente modulata dall’attività degli interneuroni inibitori nella corteccia cerebellare, comprese le cellule di Golgi, stellate e cesto4. Questa unità funzionale cerebellare è distribuita in tutti i lobuli della corteccia cerebellare. Nonostante questo circuito relativamente uniforme attraverso il cervelletto, le prove della letteratura di neuroimaging umano e degli studi sui pazienti indicano l’eterogeneità funzionale del cervelletto6,7.
La corteccia cerebellare può essere divisa in due regioni principali: il verme definito dalla linea mediana e gli emisferi laterali. Il verme può essere ulteriormente diviso in lobuli anteriori e posteriori. Queste regioni distinte del cervelletto sono state implicate nel contribuire a comportamenti diversi. I modelli di attività evocati o privi di compiti implicavano che le regioni anteriori del verme contribuiscono maggiormente alla funzione motoria mentre il verme posteriore contribuisce maggiormente alla cognizione6,7. Il verme è anche legato agli affetti e alle emozioni, mentre gli emisferi cerebellari contribuiscono alle funzioni esecutive, visivo-spaziali, linguistiche e altre funzioni mnemoniche8. Inoltre, studi anatomici hanno fornito prove che regioni cerebellari funzionalmente distinte sono collegate a diverse regioni corticali9. La mappatura delle lesioni-sintomi ha rivelato che i pazienti con ictus che colpiscono i lobuli anteriori (che si estendono nel lobulo VI) hanno avuto prestazioni più scarse nei compiti motori fini, mentre i pazienti con danni alle regioni del lobo posteriore e agli emisferi hanno mostrato deficit cognitivi in assenza di sindrome motoria cerebellare10. Infine, la patologia cerebellare regionale nella malattia indica che le regioni cerebellari funzionalmente distinte sono anche diversamente suscettibili alla malattia11,12.
Sebbene molto meno esplorate, le prove preliminari dimostrano firme di espressione genica distinte tra le regioni corticali cerebellari. L’espressione cellulare di Purkinje di Zebrin II mostra un pattern specifico della regione nel verme tale che ci sono più cellule positive di Zebrina II nei lobuli posteriori e meno nei lobuli anteriori13. Ciò è anche correlato con la funzione fisiologica distinta a livello regionale in quanto le cellule di Purkinje negative di Zebrin II mostrano una maggiore frequenza di attivazione tonica rispetto alle cellule di Purkinje che sono Zebrin IIpositive 14.
Oltre alla corteccia cerebellare, il cervelletto comprende i nuclei cerebellari profondi (DCN) che fungono da output primario per il cervelletto. I nuclei sono costituiti dai nuclei mediali (MN), interposti (IN) e laterali (LN). L’imaging funzionale e gli studi sui pazienti hanno dimostrato che il DCN partecipa anche a vari comportamenti15, ma pochissimi studi esaminano il cambiamento dell’espressione genica nel DCN.
I progressi nelle tecniche molecolari hanno permesso di valutare l’espressione genica regionale nel cervello e hanno scoperto l’eterogeneità tra e all’interno di diverse regioni del cervello sia negli stati fisiologici che in quelli patologici16. Tali studi implicano che il cervelletto è diverso dalle altre regioni del cervello. Ad esempio, il rapporto tra neuroni e cellule gliali è invertito nel cervelletto rispetto ad altre regioni del cervello1. Anche in condizioni fisiologiche normali, l’espressione dei geni proinfiammatori è sovraregolata nel cervelletto rispetto alle altre regioni cerebrali17. Le tecniche molecolari sono state anche molto utili nell’identificare le vie che contribuiscono alla patogenesi delle malattie cerebellari. Ad esempio, il sequenziamento dell’RNA di interi estratti cerebellari ha identificato geni alterati in un modello murino transgenico specifico della cellula di Purkinje di atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) rispetto ai loro controlli di tipo selvaggio. Tali evidenze hanno rivelato percorsi molecolari chiave alla base della patogenesi nelle cellule cerebellari di Purkinje e hanno contribuito a identificare potenziali bersagli terapeutici18. Tuttavia, studi recenti suggeriscono che ci sono differenze nella vulnerabilità alle malattie tra le regioni cerebellari11,12,19. Ciò potrebbe indicare che ci sono cambiamenti chiave che si verificano in regioni cerebellari distinte, che possono essere mascherate o non rilevate con interi estratti cerebellari. Pertanto, è necessario sviluppare tecniche che consentano ai ricercatori di esaminare i profili molecolari in diverse regioni cerebellari.
La tecnica qui proposta descrive un metodo riproducibile per sezionare quattro regioni distinte del cervelletto di topo al fine di isolare l’RNA da quelle regioni ed esplorare le differenze regionali nell’espressione genica. Lo schema del cervelletto del topo nella Figura 1A evidenzia il verme in blu e gli emisferi in giallo. Nello specifico, questa tecnica permette di isolare quattro regioni: i nuclei cerebellari profondi (DCN) (scatole tratteggiate di rosso in Figura 1A),la corteccia cerebellare del verme anteriore (CCaV) (blu scuro in Figura 1A),la corteccia cerebellare del verme posteriore (CCpV) (azzurro in Figura 1A),e la corteccia cerebellare degli emisferi (CCH) (gialla in Figura 1A). Valutando separatamente l’espressione genica di queste regioni, sarà possibile studiare i meccanismi molecolari alla base delle funzioni discrete di queste diverse regioni, nonché le potenziali differenze nella loro vulnerabilità alla malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto consente di valutare l’espressione genica sottostante e i meccanismi molecolari all’interno di quattro distinte regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare anteriore del verme (CCaV), la corteccia cerebellare posteriore del verme (CCpV) e la corteccia cerebellare degli emisferi (CCH). La capacità di valutare queste regioni separatamente amplierà la nostra conoscenza dell’eterogeneità di specifiche regioni cerebellari e possibilmente farà luce sul loro con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati ad Austin Ferro e Juao-Guilherme Rosa nel laboratorio Cvetanovic per il loro aiuto nella risoluzione dei problemi delle dissezioni e nell’estrazione dell’RNA e RTqPCR. Questa ricerca è finanziata da M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS National Institutes of Health (NIH).
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
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