आणविक विश्लेषण के लिए सेरिबेलर क्षेत्रीय विच्छेदन
Summary
विभिन्न सेरिबेलर क्षेत्रों को अलग व्यवहार आउटपुट में भूमिका निभाने के लिए फंसाया गया है, फिर भी अंतर्निहित आणविक तंत्र अज्ञात रहते हैं। यह काम एक विधि का वर्णन करता है जो गोलार्द्धों, पूर्वकाल और पीछे के क्षेत्रों के सेरिबेलर कॉर्टेक्स को पुन: उत्पन्न और जल्दी से विच्छेदन करने के लिए, और गहरी सेरिबेलर नाभिक आरएनए को अलग करके आणविक मतभेदों की जांच करने और जीन अभिव्यक्ति में मतभेदों के लिए परीक्षण के लिए।
Abstract
सेरिबैलम आंदोलन, संतुलन, अनुभूति, इनाम और प्रभावित के नियंत्रण सहित कई महत्वपूर्ण कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इमेजिंग अध्ययनों से संकेत मिलता है कि अलग सेरिबेलर क्षेत्र इन विभिन्न कार्यों में योगदान देते हैं। क्षेत्रीय सेरिबेलर मतभेदों की जांच करने वाले आणविक अध्ययन पिछड़ रहे हैं क्योंकि वे ज्यादातर पूरे सेरिबेलर अर्क पर किए जाते हैं जिससे विशिष्ट सेरिबेलर क्षेत्रों में किसी भी भेद को मास्किंग किया जाता है। यहां हम चार अलग-अलग सेरिबेलर क्षेत्रों को पुन: उत्पन्न और जल्दी से विच्छेदन करने की तकनीक का वर्णन करते हैं: डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी (डीसीएन), पूर्वकाल और पीछे वर्मेल सेरिबेलर कॉर्टेक्स, और गोलार्द्धों के सेरिबेलर कॉर्टेक्स। इन विशिष्ट क्षेत्रों को विच्छेदन आणविक तंत्र की खोज के लिए अनुमति देता है जो संतुलन, आंदोलन, प्रभाव और अनुभूति के लिए उनके अद्वितीय योगदान को रेखांकित कर सकता है। इस तकनीक का उपयोग विभिन्न माउस रोग मॉडलों में इन विशिष्ट क्षेत्रों के रोग संवेदनशीलता में अंतर का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है।
Introduction
सेरिबैलम में मस्तिष्क में आधे से अधिक न्यूरॉन्स होते हैं और ऐतिहासिक रूप से मस्तिष्क में एक मोटर नियंत्रण और संतुलन केंद्र के रूप में संदर्भित किया गया है1. हाल ही में, अध्ययनों से पता चला है कि सेरिबैलम अनुभूति, इनाम प्रसंस्करण सहित विभिन्न अन्य कार्यों मेंमहत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और2,3,4,5को प्रभावित करता है।
सेरिबैलम में शरीर रचना विज्ञान का अच्छी तरह से वर्णन किया गया है: कॉर्टेक्स क्षेत्र कणिका, पुरकिंजे और आणविक परतों से बना है। कणिका कोशिकाएं कणिका कोशिका परत बनाती हैं और आणविक परत के पुरकिंजे सेल डेंड्राइट्स को समानांतर फाइबर के माध्यम से इनपुट भेजती हैं जो अवर जैतून में उत्पन्न होने वाले फाइबर पर चढ़ने से इनपुट भी प्राप्त करती हैं। पुरकिंजे कोशिकाएं गहरे सेरिबेलर नाभिक (डीसीएन) में कोशिकाओं को निरोधात्मक अनुमान भेजती हैं, जो सेरिबैलम से मुख्य उत्पादन के रूप में कार्य करती है। इस सेरिबेलर सर्किट का आउटपुट गोलगी, स्टेलेट और बास्केट सेल4सहित सेरिबेलर कॉर्टेक्स में निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन्स की गतिविधि से और अधिक संग्राहक है। यह सेरिबेलर कार्यात्मक इकाई सेरिबेलर कॉर्टेक्स के सभी लॉबुल्स में वितरित की जाती है। सेरिबैलम में इस अपेक्षाकृत समान सर्किटरी के बावजूद, मानव न्यूरोइमेजिंग साहित्य और रोगी अध्ययनों के साक्ष्य सेरिबैलम6,7की कार्यात्मक विषमता को इंगित करते हैं।
सेरिबेलर कॉर्टेक्स को दो मुख्य क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: मिडलाइन-परिभाषित वर्मिस, और पार्श्व गोलार्द्ध। वर्मिस को आगे पूर्वकाल और पीछे के लोबुल्स में विभाजित किया जा सकता है। सेरिबैलम के इन अलग क्षेत्रों को विभिन्न व्यवहारों में योगदान देने में फंसाया गया है। कार्य-पैदा या कार्य मुक्त गतिविधि पैटर्न ने फंसाया कि वर्मिस के पूर्वकाल क्षेत्र मोटर फ़ंक्शन में अधिक योगदान देते हैं जबकि पीछे की वर्मिस अनुभूति6,7में अधिक योगदान देती है। वर्मिस को प्रभावित और भावनाओं से भी जोड़ा जाता है, जबकि सेरिबेलर गोलार्द्ध कार्यकारी, दृश्य-स्थानिक, भाषा और अन्य स्नेमोनिक कार्यों में योगदान देते हैं8। इसके अलावा, शारीरिक अध्ययनों ने इस बात के सबूत दिए कि कार्यात्मक रूप से अलग सेरिबेलर क्षेत्र विभिन्न कॉर्टिकल क्षेत्रों से जुड़े हुए हैं9। घाव-लक्षण मानचित्रण से पता चला है कि पूर्वकाल lobules को प्रभावित स्ट्रोक के साथ रोगियों (lobule छठी में विस्तार) ठीक मोटर कार्यों पर गरीब प्रदर्शन किया था, जबकि पीछे पालि क्षेत्रों और गोलार्द्धों को नुकसान के साथ रोगियों को सेरिबेलर मोटर सिंड्रोम10के अभाव में संज्ञानात्मक घाटे का प्रदर्शन किया । अंत में , रोग में क्षेत्रीय सेरिबेलर विकृति इंगित करती है कि कार्यात्मक रूप से अलग सेरिबेलर क्षेत्र भी रोग के लिए अलग तरह से अतिसंवेदनशीलहोतेहैं11,12.
जबकि बहुत कम पता लगाया, प्रारंभिक सबूत सेरिबेलर कॉर्टिकल क्षेत्रों में अलग जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर दर्शाता है । ज़ेब्रिन II की पुरकिंजे कोशिका अभिव्यक्ति क्षेत्र को वर्मिस में विशिष्ट पैटर्न दिखाती है जैसे कि पीछे के लोबुल्स में अधिक ज़ेब्रिन II सकारात्मक कोशिकाएं हैं और पूर्वकाल लोबुल्स13में कम हैं। यह क्षेत्रीय रूप से अलग शारीरिक कार्य से भी संबंधित है क्योंकि जेबरिन II नकारात्मक पुरकिंजे कोशिकाएं पुरकिंजे कोशिकाओं की तुलना में टॉनिक फायरिंग की उच्च आवृत्ति प्रदर्शित करती हैं जो ज़ेब्रिन II सकारात्मक14हैं।
सेरिबेलर कॉर्टेक्स के अलावा, सेरिबैलम में डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी (डीसीएन) शामिल है जो सेरिबैलम के लिए प्राथमिक उत्पादन के रूप में काम करता है। नाभिक मध्यवर्ती (एमएन), इंटरपोस्ड (आईएन), और पार्श्व नाभिक (एलएन) से बने होते हैं। कार्यात्मक इमेजिंग और रोगी अध्ययनों से पता चला है कि डीसीएन विभिन्न व्यवहारों में भी भाग लेता है15,लेकिन बहुत कम अध्ययन डीसीएन में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की जांच करते हैं।
आणविक तकनीकों में प्रगति ने मस्तिष्क में क्षेत्रीय जीन अभिव्यक्ति का आकलन करना संभव बना दिया है और शारीरिक और रोग दोनोंराज्योंमें विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में विषमता का पर्दाफाश किया है । इस तरह के अध्ययनों से यह फंसाता है कि सेरिबैलम अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से अलग है। उदाहरण के लिए, अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों की तुलना में सेरिबैलम में ग्लियल कोशिकाओं में न्यूरॉन्स का अनुपात उलटा होता है1. सामान्य शारीरिक परिस्थितियों में भी, प्रोइनफ्लेमेटरी जीन की अभिव्यक्ति अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों की तुलना में सेरिबैलम में अपृत किया जाता है17। सेरिबेलर रोगों के रोगजनन में योगदान देने वाले रास्तों की पहचान करने में आणविक तकनीक भी बहुत उपयोगी रही है। उदाहरण के लिए, पूरे सेरिबेलर अर्क के आरएनए अनुक्रमण ने अपने जंगली प्रकार के नियंत्रणों की तुलना में स्पिनोसेरेबेलर एटैक्सिया टाइप 1 (एससीए1) के पुरकिंजे सेल विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में परिवर्तित जीन की पहचान की। इस तरह के साक्ष्यों से सेरिबेलर पुरकिंजे कोशिकाओं में रोगजनकता अंतर्निहित प्रमुख आणविक मार्गों का पता चला है और इससे संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने में मदद मिली है18। हालांकि , हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सेरिबेलर क्षेत्रों में बीमारियों के प्रति संवेदनशीलता में अंतर हैं11,12,19. यह इंगित कर सकता है कि अलग-अलग सेरिबेलर क्षेत्रों में होने वाले महत्वपूर्ण परिवर्तन हैं, जो पूरे सेरिबेलर अर्क के साथ नकाबपोश या पता नहीं लगाया जा सकता है। इस प्रकार, ऐसी तकनीकों को विकसित करने की आवश्यकता है जो शोधकर्ताओं को विभिन्न सेरिबेलर क्षेत्रों में आणविक प्रोफाइल की जांच करने की अनुमति देती है।
यहां प्रस्तावित तकनीक उन क्षेत्रों से आरएनए को अलग करने और जीन अभिव्यक्ति में क्षेत्रीय मतभेदों का पता लगाने के लिए माउस सेरिबैलम के चार अलग-अलग क्षेत्रों को विच्छेदन करने के लिए एक प्रजनन विधि का वर्णन करती है। चित्रा 1A में माउस सेरिबैलम की योजनाबद्ध नीले रंग में वर्मिस और पीले रंग में गोलार्द्धों पर प्रकाश डाला गया है। विशेष रूप से, इस तकनीक से चार क्षेत्रों को अलग करना संभव हो जाता है: डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी (डीसीएन) (चित्रा 1 एमें लाल-बिंदीदार बक्से), पूर्वकाल वर्मिस (सीसीएवी) (गहरे नीले रंग में) का सेरिबेलर कॉर्टेक्स चित्रा 1A),पीछे के वर्मिस (सीसीपीवी) (चित्रा 1 एमें हल्का नीला), और गोलार्द्धों के सेरिबेलर कॉर्टेक्स (चित्रा 1 एमें पीला) का सेरिबेलर कॉर्टेक्स। इन क्षेत्रों की जीन अभिव्यक्ति का अलग से आकलन करके, इन विभिन्न क्षेत्रों के असतत कार्यों के साथ-साथ रोग में उनकी असुरक्षा में संभावित मतभेदों को अंतर्निहित आणविक तंत्रों की जांच करना संभव होगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित विधि चार अलग-अलग सेरिबेलर क्षेत्रों के भीतर अंतर्निहित जीन अभिव्यक्ति और आणविक तंत्र का आकलन करना संभव बनाती है – डीप सेरिबेलर न्यूक्लियी (डीसीएन), वर्मिस (सीसीएवी) के पूर्वकाल सेरिबेलर कॉ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ऑस्टिन फेरो और Juao-Guilherme रोजा के लिए Cvetanovic प्रयोगशाला में उनकी मदद के लिए विच्छेदन और आरएनए निष्कर्षण और RTqPCR में उनकी मदद के लिए आभारी हैं । इस शोध को एम Cvetanovic, R01 NS197387 द्वारा वित्त पोषित किया जाता है; एचएचएस | राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) ।
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region – dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. . From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , (2020).
