Qui presentiamo il protocollo per la coltura tissutale 3D dell'asse del corpo posteriore zebrafish, consentendo lo studio vivo della segmentazione dei vertebrati. Questo modello di espianto fornisce il controllo sull'allungamento dell'asse, l'alterazione delle sorgenti di morfogeno e l'imaging vivo a livello di tessuto a risoluzione subcellulare.
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Articolo metodologico
Una cultura di espianto della coda 3D per studiare la segmentazione dei vertebrati nel pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli embrioni di vertebrati modellano il loro asse corporeo principale come somiti ripetitivi, precursori di vertebre, muscoli e pelle. I somiti si segmentano progressivamente dal mesoderma presomitico (PSM) mentre l'estremità posteriore dell'embrione si allunga posteriormente. I somiti si formano con periodicità regolare e dimensioni di scala. Zebrafish è un organismo modello popolare in quanto è geneticamente trattabile e ha embrioni trasparenti che consentono l'imaging dal vivo. Tuttavia, durante la somitogenesi, gli embrioni di pesce sono avvolti attorno a un grande tuorlo rotondo. Questa geometria limita l'imaging vivo del tessuto PSM negli embrioni di zebrafish, in particolare a risoluzioni più elevate che richiedono una distanza di lavoro oggettiva ravvicinata. Qui presentiamo un metodo di coltura tissutale 3D appiattito per l'imaging vivo delle espianto della coda di zebrafish. Gli espianto della coda imitano embrioni intatti mostrando un rallentamento proporzionale dell'allungamento dell'asse e accorciamento delle lunghezze del somite rostrocaudale. Siamo inoltre in grado di bloccare la velocità di allungamento dell'asse attraverso la coltura di espianto. Questo, per la prima volta, ci permette di districare l'ingresso chimico dei gradienti di segnalazione dall'ingresso meccanicistico dell'allungamento assiale. Negli studi futuri, questo metodo può essere combinato con una configurazione microfluidico per consentire perturbazioni farmaceutiche controllate nel tempo o screening della segmentazione dei vertebrati senza problemi di penetrazione del farmaco.
Introduzione
La segmentazione metamerica degli organismi è ampiamente utilizzata in natura. Le strutture ripetute sono essenziali per la funzionalità di organi laterale come vertebre, muscoli, nervi, vasi, arti o foglie in un piano corporeo1. Come risultato di tali vincoli fisiologici e geometrici della simmetria assiale, la maggior parte della phyla della Bilateria- come anellidi, artropodi e cordati-mostrano segmentazione dei loro tessuti embrionali (ad esempio, ectoderma, mesoderma) antero-posteriormente.
Gli embrioni di vertebrati segmentano sequenzialmente il loro mesoderma parassiale lungo l'asse corporeo principale in somi....
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Protocollo
Questo protocollo prevede l'uso di embrioni vertebrati vivi di età inferiore a 1 giorno dopo la fecondazione. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida etiche del Cincinnati Children's Hospital Medical Center; protocolli animali sono stati rivisti e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (Protocollo # 2017-0048).
1. Raccolta embrionale
- Imposta coppie di zebrafish nei serbatoi di attraversamento la notte prima del giorno della raccolta degli embrioni. Per un controllo preciso della stadiazione dello sviluppo degli embrioni, utilizzare barriere tra coppie di accopp....
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Risultati
Questo protocollo consente una 155 atura geometrica piatta delle espianto di coda di zebrafish vive. La coltura tissutale presenta tre principali vantaggi rispetto agli embrioni interi: 1) controllo della velocità di allungamento dell'asse, 2) controllo su varie fonti di segnalazione (morfogeno) mediante semplice dissezione e 3) quasi obiettivo, alto ingrandimento e imaging vivo NA elevato.
Le camere di scorrimento chimicamente non trattate consentono all'espianto della coda di allungare il su.......
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Discussione
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di una tecnica di espianto di coltura tissutale che abbiamo sviluppato eutilizzato di recente 5 per gli embrioni di zebrafish. La nostra tecnica si basa sui precedenti metodi di espianto negliorganismi modello chick 8 e zebrafish9,10,11. Le esplant di coda preparate con questo protocollo possono sopravvivere fino a >12 ore in una s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare e non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'AECOM Zebrafish Core Facility e cincinnati Children's Veterinary Services per la manutenzione del pesce, il Cincinnati Children's Imaging Core per l'assistenza tecnica, Didar Saparov per l'assistenza nella produzione video e Hannah Seawall per la modifica del manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità con il numero di premio R35GM140805 a E.M.Ö. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa Sub-Q da 1 ml con ago PrecisionGlide | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | per la decoronazione di embrioni e manipolazioni |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | per l'immunocolorazione |
| Soluzione antibiotica antimicotica (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | per terreni di dissezione tissutale |
| Cloruro di calcio anidro, polvere | Sigma-Aldrich | 499609 | per terreni di dissezione tissutale |
| Dimetilsolfossido | Sigma-Aldrich | D5879 | per immunocolorazione |
| Bisturi monouso, acciaio inossidabile #10 | Integra-Miltex | MIL4-411 | per la preparazione di pozzetti di scorrimento a nastro |
| Etile 3-amminobenzoato sale metansolfonato (Tricaina) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (opzionale) per l'anestetizzazione di tessuti di età superiore a 20 somiti stadio |
| Siero fetale bovino (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | aggiuntivo per terreni di coltura tissutale |
| Capra anti-Topo IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: | AB_2535781 anticorpo secondario per l'immunocolorazione |
| L-15 Medium con L-Glutammina senza rosso fenolo | GIBCO | 21083-027 | per terreni di dissezione tissutale |
| Metanolo | Sigma-Aldrich | 179337 | per l'immunocolorazione |
| Coltello corneale microchirurgico Punta angolata da 2,85 mm Lama a doppia smussatura | Specialità chirurgiche | 72-2863 | per la dissezione tissutale |
| Monoclonale di topo anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | per l'immunocolorazione ppERK |
| NucRed Live 647 Reagente ReadyProbes | Invitrogen | R37106 | (opzionale) per la colorazione in tempo reale dei nuclei cellulari Polvere di |
| paraformaldeide, 95% | 158127 Sigma-Aldrich | per la fissazione di campioni per l'immunocolorazione Soluzione di | |
| rivestimento in collagene a coda di ratto | Sigma-Aldrich | 122-20 | (opzionale) per l'attivazione chimica delle camere di scorrimento |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (opzionale) per il controllo della temperatura durante l'imaging dal vivo |
| Nastro trasparente 3/4'' | Scotch | S-9782 | per la preparazione di pozzetti di scorrimento a nastro |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | per l'immunocolorazione |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | per l'immunocolorazione |
| Zebrafish: Tg( actb2:2xMCP-NLS-EGFP)Campbell | et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | pesce transgenico con EGFP localizzato nucleare |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | pesce transgenico con EGFP localizzato a membrana cellulare |
Riferimenti
- Assheton, R. Growth in length: Embryological Essays. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M.
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Ristampe e permessi
