미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화
Summary
지질 나노 입자는 mRNA 및 DNA 캡슐화를 위한 미세유체 혼합 플랫폼 접근 방식을 사용하여 개발됩니다.
Abstract
지질 기반 의약품 운반대는 작은 크기, 생체 적합성 및 높은 캡슐화 효율로 인해 임상 및 시판 가능한 전달 시스템에 사용되어 왔습니다. 지질 나노 입자 (LP)를 사용하여 핵산을 캡슐화하는 것은 RNA 또는 DNA를 저하로부터 보호하는 동시에 세포 섭취를 촉진하는 데 유리하다. LP는 종종 이온화 지질, 도우미 지질, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 공액 지질을 포함한 여러 지질 성분을 포함한다. LP는 이온화성 지질 존재로 인해 핵산을 쉽게 캡슐화할 수 있으며, 이는 낮은 pH에서 양이온이며 음전하 RNA 또는 DNA로 복합화를 허용합니다. 여기서 LPPs는 수성 상에서 지질 성분의 신속한 혼합을 사용하여 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 캡슐화함으로써 형성된다. 이 혼합은 정밀한 미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 수행되므로 라미나르 흐름을 유지하면서 나노 입자 자체 조립을 허용합니다. 유체역학적 크기와 다분산성은 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 측정됩니다. LNP의 유효 표면 전하는 제타 전위를 측정하여 결정됩니다. 캡슐화 효율은 힌지된 핵산을 정량화하기 위해 형광염을 사용하는 것이 특징입니다. 대표적인 결과는 이 방법의 재현성과 상이한 제형 및 공정 파라미터가 개발된 LNP에 미치는 영향을 입증한다.
Introduction
약물 운반대는 낮은 세포 독성, 생체 이용률 증가 및 향상된 안정성1,2,3을포함한 전형적인 유리한 특성을 가진치료법을보호하고 전달하는 데 사용됩니다. 중합체 나노 입자, 미셀 및 지질 계 입자는 이전에 핵산 캡슐화 및전달을위해 탐구되었다4,5,6,7. 지질은 고안정성8과생체 적합성이기 때문에 지질및 지질 나노입자를 포함한 다양한 유형의 나노캐리어 시스템에서 사용되어 왔다. LP는 유전자전달9,10을위해 핵산을 쉽게 캡슐화할 수 있다. 그들은 전신 순환(11) 동안 혈청 프로테아제에 의한 분해로부터 핵산을 보호하고 LP의 표면 지형 및 물리적 특성이 그들의 생체분포에영향을 미치기 때문에 특정 부위에 대한 전달을 향상시킬 수 있다. LP는 또한 조직 침투 및 세포 섭취를 향상9. 이전 연구는 2018년 미국 식품의약국(FDA)과 유럽의약품청에서 승인한 유전성 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증14 치료의 치료 다신경병증치료제를 함유한 최초의 상용 LNP를 포함하여 LNP13내에서 siRNA 캡슐화의 성공을 입증하였다. 최근에는 LNPs가 더 큰 핵산 모이티, 즉 mRNA 및 DNA9의전달을 위해 연구되고 있다. 2018년 현재, 22개의 지질계 핵산 전달 시스템이임상시험(14)을겪고 있었다. 또한, LP를 함유하는 mRNA는 현재 주요 후보이며 COVID-19 백신15,16에채용되었다. 이러한 비 바이러스 유전자 치료에 대한 잠재적 인 성공은 작은 형성을 필요로 (~100 nm), 안정적이고 핵산의 높은 캡슐화와 균일 한 입자.
LNP 제형의 주성분으로서 이온화지질을 사용하는 것은 복합성, 캡슐화 및 전달효율(14)에대한 이점을 보여주었다. 이온화지질은 전형적으로 산성 해리 상수(pKa) < 7을 가지며; 예를 들어, 딜리놀레틸메틸-4-디메틸아미노부티레이트(D-Lin-MC3-DMA)는 FDA 승인 LNP 제형에 사용되는 이온화지질6.4417의pKa를 가지고 있다. 낮은 pH에서, 이온화 지질에 아민 그룹은 양성되고 긍정적으로 충전되어 mRNA 및 DNA에 음전하 인산염 그룹으로 조립할 수 있게 합니다. 아민의 비율, “N”, 인산염에 대한 그룹, “P”, 그룹은 조립을 최적화하는 데 사용된다. N/P 비는 사용되는 지질 및 핵산에 의존하며, 이는제형(18)에따라 다릅니다. 형성 후, pH는 치료 적 투여를 허용하기 위해 중성 또는 생리적 pH로 조절될 수 있다. 이러한 pH 값에서, 이온화지질은 또한 LNP에 중립 표면 전하를 부여하는 데프로톤화된다.
이온화지질은 또한 내피 탈출19,20에도움이 됩니다. LP는 세포 섭취 중 내분비증을 겪고핵(21)에세포 질 또는 DNA 화물을 세포 세포질 또는 DNA 화물로 전달하기 위해 내성에서 방출되어야 한다. 내분 내부는 전형적으로 세포외 배지보다 더 산성환경이며, 이는 이온화지질을 양산하22,23로렌더링한다. 양전하 이온지질은 내피 지질 막에 대한 음전하와 상호 작용할 수 있으며, 이는 LNP 및 핵산의 방출을 허용하는 내종의 불안정을 유발할 수 있다. 다른 이온화지질은 현재 LNP 분포의 효능을 향상시키기 위해 연구되고 있으며, 내도탈출(14).
LNP의 그밖 전형적인 분대는 인산염 (PC) 또는 인포에탄올라민 (PE) 지질과 같은 도우미 지질을 포함합니다. 1,2-Dioleoyl-sn-글리세로-3-인포에탄탄민(DOPE), 1,2-디스테로일-센-글리세로-3-인포콜린(DSPC), 및 1,2-2-디오레오틸-센-글리세로-3-인포콜린(DOPC)은 일반적으로 사용되며,24. DOPE는 반전 된 육각형 II (HII) 위상을 형성하고 멤브레인 융합(26)에의한 형질을 향상시키는 것으로 나타났으며, DSPC는 원통형 기하학적기하학적 인 27로LP를 안정화시키는 것으로 생각되고 있다. 콜레스테롤은 또한 막 강성을 증가시키기 위하여 제형에 통합되고, 그 후에 LNP의 안정성을 돕습니다. 마지막으로, 지질-공주 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 입자 자가조립(27)을돕는 데 필요한 스테릭 장벽을 제공하는 제형에 포함된다. PEG는 또한 집계를 방지하여 LP의 스토리지 안정성을 향상시킵니다. 또한 PEG는 종종 스텔스 성분으로 사용되며 LP의 순환 시간을 증가시킬 수 있습니다. 그러나, 이 속성은 또한 apolipoprotein E (ApoE)28에의해 구동되는 내인성 표적 화기 장치를 통해 간구에 LP의 모집에 대한 도전을 제기할 수 있다. 따라서, 연구는 LNP에서 PEG의 확산에 대한 아실 사슬 길이를 조사하고, 짧은 길이 (C8-14) LNP에서 해리하고 더 긴 아실 길이에 비해 ApoE 모집에 더 순종발견28. 또한, PEG가 공주되는 지질꼬리의 포화정도는LP(29)의조직 분포에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 최근에는 생물학적 약물 제품 제형에 일반적으로 사용되는 계면활성제이고 오랫동안 불포화지질꼬리를 가진 트위엔(20)은 주사부위(29)에서근육을 크게 감염시킨 PEG-DSPE에 비해 림프절배수에 높은 트랜스페션을 갖는 것으로 나타났다. 이 매개 변수는 원하는 LNP 바이오 분배를 달성하기 위해 최적화 될 수있다.
종래의 LP 성형 방법은 박막 수화 방법 및 에탄올 주입방법(27)을포함한다. 이들은 쉽게 사용할 수있는 기술이지만, 그들은 또한 노동 집약적이며, 낮은 캡슐화 효율을 초래할 수 있으며,27을확장하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 혼합 기술의 발전으로 인해 더 균일한입자(27)를개발하면서 확장할 수 있는 방법이 더 많아졌다. 이러한 방법에는 T-접합 혼합, 비틀거림 헤링본 혼합, 및 미세 유체 유체 유체 역학초점(27)이 포함됩니다. 각 방법은 독특한 구조를 가지고 있지만, 모두 지질 성분을 함유하는 유기상으로 핵산을 함유하는 수상의 신속한 혼합을 허용하여핵산(27)의높은 캡슐화를 초래한다. 이 프로토콜에서는 미세 유체 카트리지를 통한 신속하고 제어된 혼합이 사용되며, 이는 비틀거리는 헤링본 혼합 설계를 사용합니다. 이 프로토콜은 LP를 포함하는 핵산의 준비, 조립 및 특성화를 간략하게 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
재현성, 속도 및 저부피 스크리닝은 다른 기존 방법(예: 지질 필름 수화 및 에탄올 주입)에 비해 LP를 형성하기 위해 미세유체 혼합을 사용하는 데 상당한 이점이 있습니다. 우리는 다른 LNP 배치로 관찰 된 캡슐화 효율이나 입자 크기에 영향을 미치지 않고이 방법의 재현성을 입증했습니다. 이것은 LP를 포함하여 어떤 치료든지, 임상적으로 유효하게 하기 위한 필수적인 기준입니다.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
아툴 살루자, 야틴 고칸, 마리아 테레사 페라키아, 월터 슈벵거, 필립 자카스가 LNP 개발에 대한 지도와 공헌에 감사드립니다.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
References
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
- Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
- Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
- Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
- Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
- Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
- Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
- Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
- Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
- Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
- Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
- Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
- Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
- Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
- Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
- Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
- Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
- Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
- Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
- Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
- Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
- NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020)
- Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
- Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
- Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).
