Formulierung und Charakterisierung von Lipid-Nanopartikeln für die Genabgabe mit einer mikrofluidischen Mischplattform
Summary
Lipid-Nanopartikel werden mit einem mikrofluidischen Mischplattformansatz für die mRNA- und DNA-Verkapselung entwickelt.
Abstract
Lipidbasierte Arzneimittelträger wurden aufgrund ihrer geringen Größe, Biokompatibilität und hohen Verkapselungseffizienz für klinisch und kommerziell verfügbare Verabreichungssysteme verwendet. Die Verwendung von Lipidnanopartikeln (LNPs) zur Verkapselung von Nukleinsäuren ist vorteilhaft, um die RNA oder DNA vor dem Abbau zu schützen und gleichzeitig die zelluläre Aufnahme zu fördern. LNPs enthalten oft mehrere Lipidkomponenten, darunter ein iionierbares Lipid, ein Helferlipid, Cholesterin und ein konjugiertes Lipid aus Polyethylenglykol (PEG). LNPs können Nukleinsäuren aufgrund der iionisierbaren Lipidpräsenz, die bei niedrigem pH-Wert kationisch ist und eine Komplexierung mit negativ geladener RNA oder DNA ermöglicht, leicht verkapseln. Hier werden LNPs durch Verkapselung von Boten-RNA (mRNA) oder Plasmid-DNA (pDNA) durch schnelles Mischen der Lipidkomponenten in einer organischen Phase und der Nukleinsäurekomponente in einer wässrigen Phase gebildet. Diese Mischung wird mit einer präzisen mikrofluidischen Mischplattform durchgeführt, die eine Selbstorganisation von Nanopartikeln bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des laminaren Flusses ermöglicht. Die hydrodynamische Größe und Polydispersität werden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) gemessen. Die effektive Oberflächenladung am LNP wird durch Messung des Zetapotentials bestimmt. Die Verkapselungseffizienz wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff charakterisiert, um die eingefangene Nukleinsäure zu quantifizieren. Repräsentative Ergebnisse belegen die Reproduzierbarkeit dieser Methode und den Einfluss, den unterschiedliche Formulierungs- und Prozessparameter auf die entwickelten LNPs haben.
Introduction
Arzneimittelträger werden verwendet, um ein Therapeutikum mit typischen günstigen Eigenschaften zu schützen und zu liefern, einschließlich niedriger Zytotoxizität, erhöhter Bioverfügbarkeit und verbesserter Stabilität1,2,3. Polymere Nanopartikel, Mizellen und lipidbasierte Partikel wurden zuvor für die Verkapselung und Abgabe von Nukleinsäuren untersucht4,5,6,7. Lipide wurden in verschiedenen Arten von Nanocarrier-Systemen verwendet, einschließlich Liposomen und Lipid-Nanopartikeln, da sie biokompatibel mit hoher Stabilität sind8. LNPs können Leicht nukleinsäuren für die Genabgabe verkapseln9,10. Sie schützen die Nukleinsäure vor dem Abbau durch Serumproteasen während der systemischenZirkulation 11 und können die Abgabe an bestimmte Stellen verbessern, da die Oberflächentopographie und die physikalischen Eigenschaften von LNPs ihre Bioverteilung beeinflussen12. LNPs verbessern auch die Gewebepenetration und die Zellaufnahme9. Frühere Studien haben den Erfolg der siRNA-Verkapselung innerhalb eines LNP13gezeigt, einschließlich des ersten kommerziell erhältlichen LNP-haltigen siRNA-Therapeutikums zur Behandlung der Polyneuropathie der hereditären Transthyretin-vermittelten Amyloidose14-Behandlung, die 2018 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel-Agentur zugelassen wurde. In jüngerer Zeit werden LNPs für die Abgabe größerer Nukleinsäureseilen untersucht, nämlich mRNA und DNA9. Ab 2018 gab es ~ 22 lipidbasierte Nukleinsäure-Verabreichungssysteme, die sich klinischen Studien unterzogen14. Darüber hinaus sind mRNA-haltige LNPs derzeit führende Kandidaten und wurden für einen COVID-19-Impfstoffeingesetzt 15,16. Der potenzielle Erfolg dieser nicht-viralen Gentherapien erfordert die Bildung kleiner (~ 100 nm), stabiler und gleichmäßiger Partikel mit hoher Verkapselung der Nukleinsäure.
Die Verwendung eines iionisierbaren Lipids als Hauptkomponente in der LNP-Formulierung hat Vorteile für die Komplexierung, Verkapselung und Abgabeeffizienz gezeigt14. Ianisierbare Lipide haben typischerweise eine Säuredissoziationskonstante (pKa) < 7; Beispielsweise hat Dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrat (D-Lin-MC3-DMA), das iionisierbare Lipid, das in der fda zugelassenen LNP-Formulierung verwendet wird, einen pKa von 6,4417. Bei niedrigem pH-Wert werden die Amingruppen auf dem iionierbaren Lipid protoniert und positiv geladen, was die Montage mit negativ geladenen Phosphatgruppen auf mRNA und DNA ermöglicht. Das Verhältnis von Amin, “N”, Gruppen zu Phosphat, “P”, Gruppen wird verwendet, um die Montage zu optimieren. Das N/P-Verhältnis ist abhängig von den verwendeten Lipiden und Nukleinsäuren, was je nach Formulierungvariiert 18. Nach der Bildung kann der pH-Wert auf einen neutralen oder physiologischen pH-Wert eingestellt werden, um eine therapeutische Verabreichung zu ermöglichen. Bei diesen pH-Werten wird auch das iionierbare Lipid deprotoniert, was dem LNP eine neutrale Oberflächenladung verleiht.
Das iionierbare Lipid hilft auch bei der endosomalen Flucht19,20. LNPs durchlaufen während der zellulären Aufnahme eine Endozytose und müssen aus dem Endosom freigesetzt werden, um die mRNA-Ladung in das Zellzytoplasma oder die DNA-Ladung in den Zellkern21zu liefern. Im Inneren des Endosoms befindet sich typischerweise eine saurere Umgebung als das extrazelluläre Medium, wodurch das iionisierbare Lipid positiv geladen wird22,23. Das positiv geladene inisierbare Lipid kann mit negativen Ladungen auf der endoosomalen Lipidmembran interagieren, was zu einer Destabilisierung des Endosoms führen kann, was die Freisetzung von LNP und Nukleinsäure ermöglicht. Verschiedene inizierbare Lipide werden derzeit untersucht, um die Wirksamkeit sowohl der LNP-Verteilung als auch der endosomalen Flucht zu verbessern14.
Andere typische Bestandteile eines LNP sind Helferlipide, wie ein Phosphatidylcholin (PC) oder Phosphoethanolamin (PE) Lipid. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) sind häufig verwendeteHilfslipide 24,25. Es wurde gezeigt, dass DOPE eine invertierte hexagonale II (HII) -Phase bildet und die Transfektion durchMembranfusion 26verbessert, während DSPC mit seiner zylindrischen Geometrie27als stabilisierend angesehen wurde. Cholesterin wird auch in die Formulierung aufgenommen, um die Membransteifigkeit zu erhöhen und anschließend die Stabilität des LNP zu unterstützen. Schließlich ist lipidkonjugiertes Polyethylenglykol (PEG) in der Formulierung enthalten, um die notwendige sterische Barriere zur Unterstützung der Partikelselbstorganisation bereitzustellen27. PEG verbessert auch die Speicherstabilität von LNPs, indem es die Aggregation verhindert. Darüber hinaus wird PEG häufig als Stealth-Komponente verwendet und kann die Umlaufzeit für die LNPs erhöhen. Dieses Attribut kann jedoch auch Herausforderungen für die Rekrutierung von LNPs für Hepatozyten durch einen endogenen Targeting-Mechanismus darstellen, der von Apolipoprotein E (ApoE)28angetrieben wird. So haben Studien die Acylkettenlänge für die Diffusion von PEG aus dem LNP untersucht und festgestellt, dass kurze Längen (C8-14) vom LNP dissoziieren und für die ApoE-Rekrutierung im Vergleich zu längeren Acyllängen besser geeignet sind28. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Sättigungsgrad des Lipidschwanzes, mit dem PEG konjugiert ist, die Gewebeverteilung von LNPs29beeinflusst. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Tween 20, ein häufig verwendetes Tensid in biologischen Arzneimittelformulierungen und einen langen ungesättigten Lipidschwanz aufwies, im Vergleich zu PEG-DSPE, das den Muskel an der Injektionsstelle weitgehend transfizierthat 29, eine hohe Transfektion in entwässernden Lymphknoten aufwies. Dieser Parameter kann optimiert werden, um die gewünschte LNP-Bioverteilung zu erreichen.
Konventionelle Methoden zur Bildung von LNPs umfassen die Dünnschichthydratationsmethode und die Ethanol-Injektionsmethode27. Während dies leicht verfügbare Techniken sind, sind sie auch arbeitsintensiv, können zu einer niedrigen Verkapselungseffizienz führen und sind schwierig zu skalieren27. Fortschritte in den Mischtechniken haben dazu geführt, dass Methoden leichter skaliert werden können, während gleichmäßigere Partikel entwickelt werden27. Diese Methoden umfassen T-Junction-Mixing, versetztes Fischgräten-Mischen und mikrofluidische hydrodynamische Fokussierung27. Jede Methode hat eine einzigartige Struktur, aber alle ermöglichen eine schnelle Vermischung einer wässrigen Phase, die die Nukleinsäure enthält, mit einer organischen Phase, die die Lipidkomponenten enthält, was zu einer hohen Verkapselung der Nukleinsäure27führt. In diesem Protokoll wird das schnelle und kontrollierte Mischen durch eine mikrofluidische Kartusche verwendet, die das gestaffelte Fischgräten-Mischdesign verwendet. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung, Montage und Charakterisierung von Nukleinsäure, die LNPs enthält.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reproduzierbarkeit, Geschwindigkeit und Screening mit geringem Volumen sind wesentliche Vorteile der Verwendung von mikrofluidischer Mischung zur Bildung von LNPs im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden (z. B. Lipidfilmhydratation und Ethanolinjektion). Wir haben die Reproduzierbarkeit dieser Methode ohne Einfluss auf die Verkapselungseffizienz oder Partikelgröße demonstriert, die bei verschiedenen LNP-Chargen beobachtet wurde. Dies ist ein wesentliches Kriterium für jedes Therapeutikum, einschließlich LNPs, um …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vielen Dank an Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger und Philip Zakas für ihre Anleitung und Beiträge zur LNP-Entwicklung.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
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