Formulación y caracterización de nanopartículas lipídicas para la administración de genes utilizando una plataforma de mezcla microfluídica
Summary
Las nanopartículas lipídicas se desarrollan utilizando un enfoque de plataforma de mezcla microfluídica para la encapsulación de ARNm y ADN.
Abstract
Los portadores de fármacos basados en lípidos se han utilizado para sistemas de administración disponibles clínica y comercialmente debido a su pequeño tamaño, biocompatibilidad y alta eficiencia de encapsulación. El uso de nanopartículas lipídicas (LNP) para encapsular ácidos nucleicos es ventajoso para proteger el ARN o el ADN de la degradación, al tiempo que promueve la absorción celular. Los LNP a menudo contienen múltiples componentes lipídicos, incluidos un lípido ionizable, lípido auxiliar, colesterol y lípido conjugado de polietilenglicol (PEG). Los LNP pueden encapsular fácilmente los ácidos nucleicos debido a la presencia de lípidos ionizables, que a pH bajo es catiónico y permite la complejación con ARN o ADN cargado negativamente. Aquí los LNPs se forman encapsulando arn mensajero (ARNm) o ADN plásmido (pDNA) utilizando la mezcla rápida de los componentes lipídicos en una fase orgánica y el componente de ácido nucleico en una fase acuosa. Esta mezcla se realiza utilizando una plataforma de mezcla microfluídica precisa, lo que permite el autoensamblaje de nanopartículas mientras se mantiene el flujo laminar. El tamaño hidrodinámico y la polidispersidad se miden mediante dispersión dinámica de la luz (DLS). La carga superficial efectiva en el LNP se determina midiendo el potencial zeta. La eficiencia de encapsulación se caracteriza utilizando un tinte fluorescente para cuantificar el ácido nucleico atrapado. Los resultados representativos demuestran la reproducibilidad de este método y la influencia que los diferentes parámetros de formulación y proceso tienen en los LNPs desarrollados.
Introduction
Los portadores de fármacos se utilizan para proteger y administrar una terapéutica con propiedades favorables típicas que incluyen baja citotoxicidad, aumento de la biodisponibilidad y mejora dela estabilidad 1,2,3. Las nanopartículas poliméricas, micelas y partículas basadas en lípidos se han explorado previamente para la encapsulación y entrega de ácidos nucleicos4,5,6,7. Los lípidos se han utilizado en diferentes tipos de sistemas de nanoportadores, incluidos los liposomas y las nanopartículas lipídicas, ya que son biocompatibles con altaestabilidad 8. Los LNP pueden encapsular fácilmente los ácidos nucleicos para la entregade genes 9,10. Protegen el ácido nucleico de la degradación por proteasas séricas durante la circulación sistémica11 y pueden mejorar la entrega a sitios específicos, ya que la topografía superficial y las propiedades físicas de los LNPs influyen en su biodistribución12. Los LNPs también mejoran la penetración tisular y la captación celular9. Estudios previos han demostrado el éxito de la encapsulación de siRNA dentro de un LNP13,incluido el primer LNP disponible comercialmente que contiene siRNA terapéutico para el tratamiento de la polineuropatía del tratamiento de la amiloidosis hereditaria mediada por transtiretina14 que fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos en 2018. Más recientemente, los LNP se están estudiando para la entrega de cantidades de ácidos nucleicos más grandes, a saber, ARNm y ADN9. A partir de 2018, había ~ 22 sistemas de administración de ácidos nucleicos basados en lípidos sometidos a ensayos clínicos14. Además, los ARNm que contienen LNPs son actualmente candidatos líderes y se han empleado para una vacuna COVID-1915,16. El éxito potencial de estas terapias génicas no virales requiere la formación de partículas pequeñas (~ 100 nm), estables y uniformes con alta encapsulación del ácido nucleico.
El uso de un lípido ionizable como componente principal en la formulación de LNP ha mostrado ventajas para la complejidad, encapsulación y eficiencia de entrega14. Los lípidos ionizables suelen tener una constante de disociación ácida (pKa) < 7; por ejemplo, dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), el lípido ionizable utilizado en la formulación de LNP aprobada por la FDA, tiene un pKa de 6.4417. A pH bajo, los grupos amina en el lípido ionizable se protonan y cargan positivamente, lo que permite el ensamblaje con grupos fosfato cargados negativamente en ARNm y ADN. La proporción de grupos amina, “N”, a fosfato, “P”, se utiliza para optimizar el ensamblaje. La relación N/P depende de los lípidos y ácidos nucleicos utilizados, que varían en función de la formulación18. Después de la formación, el pH se puede ajustar a un pH neutro o fisiológico para permitir la administración terapéutica. A estos valores de pH, el lípido ionizable también se desprotona, lo que imparte carga superficial neutra al LNP.
El lípido ionizable también ayuda en el escape endosomal19,20. Los LNP sufren endocitosis durante la absorción celular y deben liberarse del endosoma para entregar la carga de ARNm en el citoplasma celular o la carga de ADN al núcleo21. Dentro del endosoma es típicamente un ambiente más ácido que el medio extracelular, lo que hace que el lípido ionizable cargado positivamente22,23. El lípido ionizable cargado positivamente puede interactuar con cargas negativas en la membrana lipídica endosomal, lo que puede causar desestabilización del endosoma permitiendo la liberación del LNP y el ácido nucleico. Actualmente se están estudiando diferentes lípidos ionizables para mejorar la eficacia tanto de la distribución de LNP, como del escape endosomal14.
Otros componentes típicos de un LNP incluyen lípidos auxiliares, como un lípido fosfatidilcolina (PC) o fosfoetanolamina (PE). 1,2-Dioleoyl-sn -glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) son lípidos auxiliares de uso común24,25. Se ha demostrado que el DOPE forma una fase hexagonal II invertida (HII) y mejora la transfección por fusión de membrana26,mientras que se ha pensado que el DSPC estabiliza los LNPs con su geometría cilíndrica27. El colesterol también se incorpora en la formulación para aumentar la rigidez de la membrana, ayudando posteriormente en la estabilidad de la LNP. Finalmente, el polietilenglicol conjugado con lípidos (PEG) se incluye en la formulación para proporcionar la barrera estérica necesaria para ayudar en el autoensamblaje de partículas27. PEG también mejora la estabilidad de almacenamiento de los LNP al evitar la agregación. Además, PEG se utiliza a menudo como un componente sigiloso y puede aumentar el tiempo de circulación de los LNP. Sin embargo, este atributo también puede plantear desafíos para el reclutamiento de LNPs a hepatocitos a través de un mecanismo de orientación endógeno impulsado por la apolipoproteína E (ApoE)28. Por lo tanto, los estudios han investigado la longitud de la cadena de acilo para la difusión de PEG desde el LNP, encontrando que las longitudes cortas (C8-14) se disocian del LNP y son más susceptibles al reclutamiento de ApoE en comparación con las longitudes de acilo más largas28. Además, se ha demostrado que el grado de saturación de la cola lipídica con la que se conjuga el PEG influye en la distribución tisular de los LNPs29. Recientemente, se demostró que Tween 20, que es un surfactante de uso común en formulaciones de productos farmacéuticos biológicos y tiene una larga cola lipídica insaturada, tiene una alta transfección en los ganglios linfáticos drenantes en comparación con PEG-DSPE, que transfectó en gran medida el músculo en el sitio de inyección29. Este parámetro se puede optimizar para lograr la biodistribución LNP deseada.
Los métodos convencionales de formación de LNPs incluyen el método de hidratación de película delgada y el método de inyección de etanol27. Si bien estas son técnicas fácilmente disponibles, también requieren mucha mano de obra, pueden resultar en una baja eficiencia de encapsulación y son difíciles de escalar27. Los avances en las técnicas de mezcla han dado como resultado métodos más susceptibles de escalar, mientras que el desarrollo de partículas más uniformes27. Estos métodos incluyen la mezcla de unión en T, la mezcla escalonada de espiga y el enfoque hidrodinámico microfluídico27. Cada método tiene una estructura única, pero todos permiten la mezcla rápida de una fase acuosa que contiene el ácido nucleico con una fase orgánica que contiene los componentes lipídicos, lo que resulta en una alta encapsulación del ácido nucleico27. En este protocolo, se utiliza una mezcla rápida y controlada a través de un cartucho microfluídico, que emplea el diseño de mezcla escalonada de espiga. Este protocolo describe la preparación, ensamblaje y caracterización de ácidos nucleicos que contienen LNPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
La reproducibilidad, la velocidad y el cribado de bajo volumen son ventajas significativas del uso de la mezcla microfluídica para formar LNPs en comparación con otros métodos existentes (por ejemplo, hidratación de la película lipídica e inyección de etanol). Hemos demostrado la reproducibilidad de este método sin impacto en la eficiencia de encapsulación o el tamaño de partícula observado con diferentes lotes de LNP. Este es un criterio esencial para que cualquier terapia, incluidos los LNP, esté clínicame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gracias a Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger y Philip Zakas por su orientación y contribuciones al desarrollo de LNP.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
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