JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Published: February 25, 2021
doi:
10.3791/62226
, , , ,
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing,Sanofi, Framingham, Massachusetts

Summary

Lipid nanopartikülleri mRNA ve DNA kapsülleme için mikroakışkan karıştırma platformu yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiştir.

Abstract

Lipid bazlı ilaç taşıyıcıları, küçük boyutları, biyouyumlulukları ve yüksek kapsülleme verimlilikleri nedeniyle klinik ve ticari olarak mevcut doğum sistemleri için kullanılmıştır. Nükleik asitleri kapsüllemek için lipid nanopartiküllerinin (LNP) kullanılması, RNA veya DNA’yı bozulmaya karşı korurken hücresel alımı teşvik etmek için avantajlıdır. LNP’ler genellikle iyotlu lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve polietilen glikol (PEG) konjuge lipid dahil olmak üzere birden fazla lipit bileşeni içerir. LNP’ler, düşük pH’da katyonik olan ve negatif yüklü RNA veya DNA ile komplekslenme sağlayan iyonizlenebilir lipid varlığı nedeniyle nükleik asitleri kolayca kapsülleyebilir. Burada LNP’ler, lipid bileşenlerinin organik bir fazda ve nükleik asit bileşeninin sulu bir fazda hızlı bir şekilde karıştırılması kullanılarak haberci RNA (mRNA) veya plazmid DNA’nın (pDNA) kapsüllenerek oluşturulur. Bu karıştırma, laminar akışı korurken nanopartikül kendi kendine montajına izin vererek hassas bir mikroakışkan karıştırma platformu kullanılarak gerçekleştirilir. Hidrodinamik boyut ve polidisperite dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanılarak ölçülür. LNP üzerindeki etkili yüzey yükü, zeta potansiyeli ölçülerek belirlenir. Kapsülleme verimliliği, tuzaklanmış nükleik asidi ölçmek için floresan bir boya kullanılarak karakterize edilir. Temsili sonuçlar, bu yöntemin tekrarlanabilirliğini ve farklı formülasyon ve işlem parametrelerinin geliştirilen LNP’ler üzerindeki etkisini göstermektedir.

Introduction

İlaç taşıyıcıları, düşük sitotoksiklik, artan biyoyararlanlık ve gelişmiş stabilite1,2,3dahil olmak üzere tipik elverişli özelliklere sahip bir terapötik korumak ve sunmak için kullanılır. Polimerik nanopartiküller, miseller ve lipid bazlı parçacıklar daha önce nükleik asit kapsülleme ve teslimi için araştırılmıştır4,5,6,7. Lipitler, yüksek stabilite ile biyouyumlu oldukları için lipozomlar ve lipid nanopartiküller de dahil olmak üzere farklı nanokarrier sistemlerinde kullanılmıştır8. LNP’ler gen iletimi için nükleik asitleri kolayca kapsülleyebilir9,10. Sistemik dolaşım11 sırasında nükleik asidi serum proteazları tarafından bozulmaya karşı korurlar ve LNP’lerin yüzey topografyası ve fiziksel özellikleri biyodistribution12’yietkilediği için belirli bölgelere teslimatı artırabilirler. LNP’ler ayrıca doku penetrasyonunu ve hücresel alımı iyileştirir9. Önceki çalışmalar, 2018 yılında Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı tarafından onaylanan kalıtsal transtiretein aracılı amiloidoz14 tedavisinin tedavi polinöropatisi için siRNA terapötik içeren ilk ticari olarak mevcut LNP de dahil olmak üzere, bir LNP13içinde siRNA kapsüllemenin başarısını göstermiştir. Daha yakın zamanda, LNP’ler daha büyük nükleik asit moieties, yani mRNA ve DNA9’unteslimi için çalışılmaktadır. 2018 itibariyle, klinik çalışmalardan geçen ~ 22 lipid bazlı nükleik asit iletim sistemi vardı14. Ek olarak, LNP’leri içeren mRNA şu anda önde gelen adaylardır ve COVID-19 aşısı15,16için istihdam edilmiştir. Bu viral olmayan gen tedavileri için potansiyel başarı, nükleik asidin yüksek kapsüllenmesine sahip küçük (~100 nm), kararlı ve düzgün parçacıklar oluşturmayı gerektirir.

LNP formülasyonunda ana bileşen olarak iyotlu bir lipit kullanımı karmaşıklık, kapsülleme ve teslimat efekti14için avantajlar göstermiştir. Iyâne edilebilir lipitler tipik olarak 7 < asit ayrışma sabiti (pKa) vardır; örneğin, DILINOLEYLMETHYL-4-dimetilaminobütirat (D-Lin-MC3-DMA), FDA onaylı LNP formülasyonunda kullanılan iyonlaşabilir lipit, 6.4417pKa’ya sahiptir. Düşük pH’da, iyotlanabilir lipid üzerindeki amin grupları protonlanır ve pozitif olarak şarj edilir, bu da mRNA ve DNA’da negatif yüklü fosfat grupları ile montaja izin verir. Amin oranı, “N”, gruplar fosfat, “P”, gruplar montajı optimize etmek için kullanılır. Yok oranı, formülasyona bağlı olarak değişen lipitlere ve kullanılan nükleik asitlere bağlıdır18. Oluşumdan sonra, pH terapötik uygulama için nötr veya fizyolojik bir pH’a ayarlanabilir. Bu pH değerlerinde, iyotlanabilir lipit de LNP’ye nötr yüzey yükü veren deprotonated edilir.

Iyotlu lipid ayrıca endosomal kaçış19,20. LNP’ler hücresel alım sırasında endositoz geçirir ve mRNA kargosunu hücre sitoplazması veya DNA kargosuna çekirdek21’eteslim etmek için endozomdan salınmalıdır. Endozom içinde tipik olarak hücre dışı ortamdan daha asidik bir ortam vardır, bu da iyotlanabilir lipidi pozitif yüklü hale getirir22,23. Pozitif yüklü iyonizlenebilir lipid, endosomal lipid zarındaki negatif yüklerle etkileşime girebilir, bu da endozomun LNP ve nükleik asidin salınmasına izin veren istikrarsızlaşmasına neden olabilir. Farklı iyotlanabilir lipitler şu anda hem LNP dağılımının hem de endosomal kaçış14‘ün etkinliğini artırmak için incelenmektedir.

Bir LNP’nin diğer tipik bileşenleri arasında fosfatidikolin (PC) veya fosfotitananolamin (PE) lipid gibi yardımcı lipitler bulunur. 1,2-Dioleoyl-sn-glisero-3-fosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosphocholine (DSPC) ve 1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) yaygın olarak kullanılan yardımcı lipitler24,25. DOPE’un ters altıgen II (HII) fazı oluşturduğu ve membran füzyonu26ile transfeksiyonu artırdığı gösterilmiştir, DSPC’nin silindirik geometrisi27ile LNP’leri stabilize ettiği düşünülmektedir. Kolesterol ayrıca membran sertliğini artırmak için formülasyona dahil edilir ve daha sonra LNP’nin stabilitesine yardımcı olan. Son olarak, lipid konjuge polietilen glikol (PEG), parçacık kendi kendine montajına yardımcı olmak için gerekli sterik bariyeri sağlamak için formülasyona dahil edilir27. PEG ayrıca toplamayı önleyerek LNP’lerin depolama kararlılığını artırır. Ayrıca, PEG genellikle gizli bir bileşen olarak kullanılır ve LNP’ler için dolaşım süresini artırabilir. Bununla birlikte, bu özellik, apolipoprotein E (ApoE)28tarafından yönlendirilen endojen bir hedefleme mekanizması aracılığıyla LNP’lerin hepatositlere işe alınması için de zorluklar doğurabilir. Bu nedenle, çalışmalar PEG’in LNP’den yayılması için acyl zincir uzunluğunu araştırmıştır, kısa uzunlukların (C8-14) LNP’den ayrıştığını ve daha uzun acyl uzunluklarına kıyasla ApoE işe alımına daha uygun olduğunu tespitederek 28. Ayrıca, PEG’in eşlendiği lipid kuyruğunun doygunluk derecesinin LNP’lerin doku dağılımını etkilediği gösterilmiştir29. Son zamanlarda, biyolojik ilaç ürünü formülasyonlarında yaygın olarak kullanılan bir yüzey aktif madde olan ve uzun bir doymamış lipit kuyruğuna sahip olan Tween 20’nin, enjeksiyon bölgesinde kası büyük ölçüde transktasyon yapan PEG-DSPE’ye kıyasla lenf düğümlerinin boşaltılmasında yüksek transfeksiyona sahip olduğu gösterilmiştir29. Bu parametre istenen LNP biyodistribution elde etmek için optimize edilebilir.

LNP’leri oluşturmanın geleneksel yöntemleri ince film hidrasyon yöntemini ve etanol enjeksiyon yönteminiiçerir 27. Bunlar kolayca kullanılabilen teknikler olsa da, aynı zamanda emek yoğundur, düşük kapsülleme verimliliğine neden olabilir ve27’yiölçeklendirmek zordur. Karıştırma tekniklerindeki gelişmeler, daha düzgün parçacıklar geliştirirken, ölçek büyütmek için daha uygun yöntemlerle sonuçlanmıştır27. Bu yöntemler arasında T-junction karıştırma, sendelemiş balıksırtı karıştırma ve mikroakışkan hidrodinamik odaklama27bulunur. Her yöntemin benzersiz bir yapısı vardır, ancak hepsi nükleik asidi içeren sulu bir fazın lipid bileşenlerini içeren organik bir fazla hızlı bir şekilde karıştırılmasına izin verir ve bu da nükleik asidin yüksek kapsüllenmesine neden27. Bu protokolde, kademeli balıksırtı karıştırma tasarımını kullanan mikroakışkan bir kartuş aracılığıyla hızlı ve kontrollü karıştırma kullanılır. Bu protokol, LNP’ler içeren nükleik asidin hazırlanmasını, montajını ve karakterizasyonunu özetler.

Protocol

Şekil 1 ‘de genel işlemin şeması verilmiştir. 1. Tamponların hazırlanması NOT: Tamponların steril filtrelanması, nükleik asit ve LNP kalitesini etkileyebilecek partikülleri çıkarmak için burada şiddetle tavsiye edilir. Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS) Nükleaz içermeyen suda 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl ve 2,7 mM KCl kullanarak 1x PBS hazırlayın ve pH’?…

Representative Results

Tekniğin tekrarlanabilirliğini göstermek için ayrı günlerde aynı lipit formülasyonuna ve 6 N/P oranına sahip birden fazla LNP grubu geliştirilmiştir. Toplu iş 1 ve 2, benzer polidispersiteye sahip boyut dağılımlarının çakışmasına neden oldu (Şekil 2A) İki farklı parti arasındaki boyut veya kapsülleme verimliliğinde önemli bir fark gözlenmedi (Şekil 2B). Kapsülleme verimliliği her parti için yükse…

Discussion

Tekrarlanabilirlik, hız ve düşük hacimli tarama, diğer mevcut yöntemlere (örneğin, lipid film hidrasyon ve etanol enjeksiyonu) kıyasla LNP’leri oluşturmak için mikroakışkan karıştırma kullanmanın önemli avantajlarıdır. Bu yöntemin tekrarlanabilirliğini, farklı LNP partileriyle gözlenen kapsülleme verimliliği veya partikül boyutu üzerinde hiçbir etkisi olmadan gösterdik. Bu, LNP’ler de dahil olmak üzere herhangi bir terapötik tedavinin klinik olarak kullanılabilir hale gelmesi için gerekl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger ve Philip Zakas’a LNP gelişimine yönelik rehberlikleri ve katkıları için teşekkür ederiz.

Materials

1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) Avanti Polar Lipids 880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) Sigma-Aldrich C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) Thermo Fisher Scientific 23-021-020
Benchtop Centrifuge Beckman coulter
Black 96 well plates Thermo Fisher Scientific 14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 14-380-813
Citric Acid Fisher Scientific 02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore Corning 430769
Disposable folded capillary cells Malvern DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof Sigma-Aldrich 459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette Thermo Fisher Scientific 14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) Thermo Fisher Scientific AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units Thermo Fisher Scientific UFC901024
NanoAssemblr Benchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific R11490
Sodium Chloride Fisher Scientific 02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular Fisher Scientific 02-004-056
SpectraMax i3x Molecular Devices
Zetasizer Nano Malvern
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
  3. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
  4. Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
  5. Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
  6. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  7. Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
  8. Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
  9. Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
  10. Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
  11. Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
  12. Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
  13. Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
  14. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
  15. Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
  16. Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
  17. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
  18. Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
  21. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  22. Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
  23. Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  24. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
  25. Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
  26. Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
  27. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
  28. Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
  29. Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
  30. NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020)
  31. Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
  32. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
  33. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
  34. Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
  35. Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
  36. Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).

Tags

Keywords: Lipid NanoparticlesGene DeliveryMicrofluidic MixingNucleic Acid EncapsulationFormulation ParametersBio DistributionHerringbone DesignScaling UpUniform ParticlesNon-viral Gene DeliveryMRNACitrate BufferPrimingWaste ContainersSyringe LoadingAir BubblesFormulation Parameters
check_url/62226?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform. J. Vis. Exp. (168), e62226, doi:10.3791/62226 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image