Formulation et caractérisation de nanoparticules lipidiques pour la livraison de gènes à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique
Summary
Les nanoparticules lipidiques sont développées à l’aide d’une approche de plate-forme de mélange microfluidique pour l’encapsulation de l’ARNm et de l’ADN.
Abstract
Les transporteurs de médicaments à base de lipides ont été utilisés pour les systèmes d’administration cliniquement et commercialement disponibles en raison de leur petite taille, de leur biocompatibilité et de leur grande efficacité d’encapsulation. L’utilisation de nanoparticules lipidiques (LNPs) pour encapsuler les acides nucléiques est avantageuse pour protéger l’ARN ou l’ADN de la dégradation, tout en favorisant l’absorption cellulaire. Les LLP contiennent souvent plusieurs composants lipidiques, y compris un lipide ionisable, un lipide d’aide, du cholestérol et un lipide conjugué en polyéthylène glycol (PEG). Les LNPs peuvent facilement encapsuler les acides nucléiques en raison de la présence de lipides ionisables, qui, à faible pH, est cationique et permet une complexation avec de l’ARN ou de l’ADN chargé négativement. Ici, les LNPs sont formés en encapsulant l’ARN messager (ARNm) ou l’ADN plasmidique (ADNp) en mélangeant rapidement les composants lipidiques dans une phase organique et le composant acide nucléique dans une phase aqueuse. Ce mélange est effectué à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique précise, permettant l’auto-assemblage des nanoparticules tout en maintenant le flux laminaire. La taille hydrodynamique et la polydispersité sont mesurées à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). La charge de surface effective sur le LNP est déterminée en mesurant le potentiel zêta. L’efficacité d’encapsulation est caractérisée à l’aide d’un colorant fluorescent pour quantifier l’acide nucléique piégé. Des résultats représentatifs démontrent la reproductibilité de cette méthode et l’influence des différents paramètres de formulation et de procédé sur les LNP développés.
Introduction
Les transporteurs de médicaments sont utilisés pour protéger et délivrer un traitement aux propriétés favorables typiques, notamment une faible cytotoxicité, une biodisponibilité accrue et une stabilité améliorée1,2,3. Les nanoparticules polymères, les micelles et les particules à base de lipides ont déjà été explorées pour l’encapsulation et la livraison d’acides nucléiques4,5,6,7. Les lipides ont été utilisés dans différents types de systèmes de nanotransporteurs, y compris les liposomes, et les nanoparticules lipidiques, car ils sont biocompatibles avec une grande stabilité8. Les LNPs peuvent facilement encapsuler les acides nucléiques pour l’administration de gènes9,10. Ils protègent l’acide nucléique de la dégradation par les protéases sériques au cours de la circulation systémique11 et peuvent améliorer l’administration à des sites spécifiques, car la topographie de surface et les propriétés physiques des LNP influencent leur biodistribution12. Les LLP améliorent également la pénétration tissulaire et l’absorption cellulaire9. Des études antérieures ont démontré le succès de l’encapsulation du siRNA dans un LNP13, y compris le premier LNP disponible dans le commerce contenant du siRNA thérapeutique pour le traitement de la polyneuropathie du traitement héréditaire de l’amylose héréditaire médiée par la transthyrétine14 qui a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis et l’Agence européenne des médicaments en 2018. Plus récemment, les LNP sont à l’étude pour l’administration de fractions d’acides nucléiques plus importantes, à savoir l’ARNm et l’ADN9. En 2018, il y avait ~ 22 systèmes d’administration d’acides nucléiques à base de lipides en cours d’essais cliniques14. De plus, les ARNm contenant des LLP sont actuellement les principaux candidats et ont été utilisés pour un vaccin contre laCOVID-19 15,16. Le succès potentiel de ces thérapies géniques non virales nécessite la formation de petites particules (~ 100 nm), stables et uniformes avec une encapsulation élevée de l’acide nucléique.
L’utilisation d’un lipide ionisable comme composant principal dans la formulation LNP a montré des avantages pour la complexation, l’encapsulation et l’efficacité de l’administration14. Les lipides ionisables ont généralement une constante de dissociation acide (pKa) < 7; par exemple, le dilinoleylméthyl-4-diméthylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), le lipide ionisable utilisé dans la formulation LNP approuvée par la FDA, a un pKa de 6,4417. À faible pH, les groupes amines sur le lipide ionisable deviennent protonés et chargés positivement, ce qui permet l’assemblage avec des groupes phosphate chargés négativement sur l’ARNm et l’ADN. Le rapport des groupes amine, « N », aux groupes phosphate, « P », est utilisé pour optimiser l’assemblage. Le rapport N/P dépend des lipides et des acides nucléiques utilisés, qui varie en fonction de la formulation18. Après la formation, le pH peut être ajusté à un pH neutre ou physiologique pour permettre l’administration thérapeutique. À ces valeurs de pH, le lipide ionisable est également déprotoné, ce qui confère une charge de surface neutre au LNP.
Le lipide ionisable aide également à l’évasion endosomale19,20. Les LNP subissent une endocytose pendant l’absorption cellulaire et doivent être libérés de l’endosome afin de délivrer la cargaison d’ARNm dans le cytoplasme cellulaire ou la cargaison d’ADN au noyau21. À l’intérieur de l’endosome se trouve généralement un environnement plus acide que le milieu extracellulaire, ce qui rend le lipide ionisable chargé positivement22,23. Le lipide ionisable chargé positivement peut interagir avec des charges négatives sur la membrane lipidique endosomale, ce qui peut provoquer une déstabilisation de l’endosome permettant la libération du LNP et de l’acide nucléique. Différents lipides ionisables sont actuellement à l’étude pour améliorer l’efficacité de la distribution de la LNP, ainsi que de l’échappement endosomale14.
D’autres composants typiques d’un LNP comprennent les lipides d’aide, tels qu’un lipide de phosphatidylcholine (PC) ou de phosphoéthanolamine (PE). La 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), la 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et la 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) sont des lipides d’aide couramment utilisés24,25. Il a été démontré que le DOPE forme une phase HEXAGONALE II inversée (HII) et améliore la transfection par fusion membranaire26,tandis que le DSPC a été pensé pour stabiliser les LNP avec sa géométrie cylindrique27. Le cholestérol est également incorporé dans la formulation afin d’augmenter la rigidité de la membrane, aidant ainsi à la stabilité du LNP. Enfin, le polyéthylène glycol conjugué aux lipides (PEG) est inclus dans la formulation pour fournir la barrière stérique nécessaire pour aider à l’auto-assemblage des particules27. Peg améliore également la stabilité de stockage des LNPs en empêchant l’agrégation. De plus, le PEG est souvent utilisé comme composant furtif et peut augmenter le temps de circulation des LLP. Cependant, cet attribut peut également poser des défis pour le recrutement des LNP en hépatocytes par le biais d’un mécanisme de ciblage endogène piloté par l’apolipoprotéine E (ApoE)28. Ainsi, des études ont étudié la longueur de la chaîne acyle pour la diffusion du PEG à partir du LNP, constatant que les longueurs courtes (C8-14) se dissocient du LNP et se prêtent mieux au recrutement d’ApoE par rapport aux longueurs d’acyle plus longues28. De plus, il a été démontré que le degré de saturation de la queue lipidique à laquelle le PEG est conjugué influence la distribution tissulaire des LLP29. Récemment, Tween 20, qui est un tensioactif couramment utilisé dans les formulations de produits pharmaceutiques biologiques et a une longue queue lipidique insaturée, s’est avéré avoir une transfection élevée dans les ganglions lymphatiques drainants par rapport au PEG-DSPE, qui transfectait en grande partie le muscle au site d’injection29. Ce paramètre peut être optimisé pour obtenir la biodistribution LNP souhaitée.
Les méthodes conventionnelles de formation de LNPs comprennent la méthode d’hydratation en couche mince et la méthode d’injectiond’éthanol 27. Bien qu’il s’agit de techniques facilement disponibles, elles exigent également beaucoup de main-d’œuvre, peuvent entraîner une faible efficacité d’encapsulation et sont difficiles à mettre à l’échelle27. Les progrès dans les techniques de mélange ont abouti à des méthodes plus faciles à mettre à l’échelle, tout en développant des particules plus uniformes27. Ces méthodes comprennent le mélange de jonction en T, le mélange à chevrons décalé et la focalisation hydrodynamique microfluidique27. Chaque méthode a une structure unique, mais toutes permettent de mélanger rapidement une phase aqueuse contenant l’acide nucléique avec une phase organique contenant les composants lipidiques, ce qui entraîne une encapsulation élevée de l’acide nucléique27. Dans ce protocole, un mélange rapide et contrôlé à travers une cartouche microfluidique est utilisé, qui utilise la conception de mélange à chevrons décalé. Ce protocole décrit la préparation, l’assemblage et la caractérisation des acides nucléiques contenant des LLP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La reproductibilité, la rapidité et le criblage à faible volume sont des avantages importants de l’utilisation du mélange microfluidique pour former des LLP par rapport à d’autres méthodes existantes (par exemple, l’hydratation du film lipidique et l’injection d’éthanol). Nous avons démontré la reproductibilité de cette méthode sans impact sur l’efficacité d’encapsulation ou la taille des particules observée avec différents lots LNP. Il s’agit d’un critère essentiel pour que tout traiteme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merci à Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger et Philip Zakas pour leurs conseils et leurs contributions au développement de LNP.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
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