Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica
Summary
Le nanoparticelle lipidiche sono sviluppate utilizzando un approccio di piattaforma di miscelazione microfluidica per l’incapsulamento di mRNA e DNA.
Abstract
I vettori di farmaci a base lipidica sono stati utilizzati per i sistemi di somministrazione clinicamente e commercialmente disponibili grazie alle loro piccole dimensioni, alla biocompatibilità e all’elevata efficienza di incapsulamento. L’uso di nanoparticelle lipidiche (LNP) per incapsulare gli acidi nucleici è vantaggioso per proteggere l’RNA o il DNA dalla degradazione, promuovendo al contempo l’assorbimento cellulare. Gli LNP contengono spesso più componenti lipidici tra cui un lipide ionizzabile, lipide helper, colesterolo e lipide coniugato polietilenglicole (PEG). Gli LNP possono facilmente incapsulare gli acidi nucleici a causa della presenza lipidica ionizzabile, che a basso pH è cationica e consente la complessazione con RNA o DNA caricati negativamente. Qui gli LNP sono formati incapsulando l’RNA messaggero (mRNA) o il DNA plasmidico (pDNA) utilizzando una rapida miscelazione dei componenti lipidici in una fase organica e della componente dell’acido nucleico in una fase acquosa. Questa miscelazione viene eseguita utilizzando una precisa piattaforma di miscelazione microfluidica, che consente l’autoassemblaggio delle nanoparticelle mantenendo il flusso laminare. Le dimensioni idrodinamiche e la polidispersità sono misurate utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS). La carica superficiale effettiva sull’LNP è determinata misurando il potenziale zeta. L’efficienza di incapsulamento è caratterizzata utilizzando un colorante fluorescente per quantificare l’acido nucleico intrappolato. Risultati rappresentativi dimostrano la riproducibilità di questo metodo e l’influenza che i diversi parametri di formulazione e di processo hanno sui LNP sviluppati.
Introduction
I vettori farmaceutici sono utilizzati per proteggere e fornire una terapia con proprietà favorevoli tipiche tra cui bassa citotossicità, aumento della biodisponibilità e miglioramento della stabilità1,2,3. Nanoparticelle polimeriche, micelle e particelle a base lipidica sono state precedentemente esplorate per l’incapsulamento e il rilascio di acidi nucleici4,5,6,7. I lipidi sono stati utilizzati in diversi tipi di sistemi nanocarrier, compresi i liposomi e le nanoparticelle lipidiche, in quanto sono biocompatibili con elevata stabilità8. Gli LNP possono facilmente incapsulare gli acidi nucleici per la consegnagenica 9,10. Proteggono l’acido nucleico dalla degradazione da parte delle proteasi sieriche durante la circolazione sistemica11 e possono migliorare la consegna a siti specifici, poiché la topografia superficiale e le proprietà fisiche delle LNP influenzano la loro biodistribuzione12. Gli LNP migliorano anche la penetrazione dei tessuti e l’assorbimento cellulare9. Studi precedenti hanno dimostrato il successo dell’incapsulamento di siRNA all’interno di un LNP13, incluso il primo LNP disponibile in commercio contenente siRNA terapeutico per il trattamento della polineuropatia del trattamento ereditario con amiloidosi14 mediata da transtiretina che è stato approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti e dall’Agenzia europea per i medicinali nel 2018. Più recentemente, gli LNP sono stati studiati per la consegna di porzioni di acido nucleico più grandi, vale a dire mRNA e DNA9. A partire dal 2018, c’erano ~ 22 sistemi di somministrazione di acidi nucleici a base lipidica sottoposti a studi clinici14. Inoltre, gli mRNA contenenti LNP sono attualmente candidati principali e sono stati impiegati per un vaccino COVID-1915,16. Il potenziale successo di queste terapie geniche non virali richiede la formazione di particelle piccole (~ 100 nm), stabili e uniformi con un elevato incapsulamento dell’acido nucleico.
L’uso di un lipide ionizzabile come componente principale nella formulazione LNP ha mostrato vantaggi per la complessazione, l’incapsulamento e l’efficienza di consegna14. I lipidi ionizzabili hanno tipicamente una costante di dissociazione acida (pKa) < 7; ad esempio, il dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), il lipide ionizzabile utilizzato nella formulazione LNP approvata dalla FDA, ha un pKa di 6,4417. A pH basso, i gruppi amminici sul lipide ionizzabile diventano protonati e caricati positivamente, consentendo l’assemblaggio con gruppi fosfato caricati negativamente su mRNA e DNA. Il rapporto tra ammina, “N”, gruppi e fosfato, “P”, gruppi viene utilizzato per ottimizzare l’assemblaggio. Il rapporto N/P dipende dai lipidi e dagli acidi nucleici utilizzati, che variano a seconda della formulazione18. Dopo la formazione, il pH può essere regolato su un pH neutro o fisiologico per consentire la somministrazione terapeutica. A questi valori di pH, il lipide ionizzabile viene anche deprotonato che conferisce carica superficiale neutra al LNP.
Il lipide ionizzabile aiuta anche nella fuga endosomiale19,20. Gli LNP subiscono endocitosi durante l’assorbimento cellulare e devono essere rilasciati dall’endosoma per consegnare il carico di mRNA nel citoplasma cellulare o nel carico di DNA al nucleo21. All’interno dell’endosoma c’è tipicamente un ambiente più acido rispetto al mezzo extracellulare, che rende il lipide ionizzabile caricato positivamente22,23. Il lipide ionizzabile caricato positivamente può interagire con cariche negative sulla membrana lipidica endosomiale, che può causare la destabilizzazione dell’endosoma consentendo il rilascio dell’LNP e dell’acido nucleico. Diversi lipidi ionizzabili sono attualmente in fase di studio per migliorare l’efficacia sia della distribuzione LNP, sia della fuga endosomiale14.
Altri componenti tipici di un LNP includono lipidi helper, come un fosfatidilcolina (PC) o fosfoetanolammina (PE) lipide. 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) sono lipidi helper comunemente usati24,25. DoPE ha dimostrato di formare una fase esagonale invertita II (HII) e migliorare la trasfezione mediante fusione di membrana26, mentre DSPC è stato pensato per stabilizzare LNP con la sua geometria cilindrica27. Il colesterolo è anche incorporato nella formulazione al fine di aumentare la rigidità della membrana, aiutando successivamente nella stabilità del LNP. Infine, il polietilenglicole coniugato con lipidi (PEG) è incluso nella formulazione per fornire la barriera sterica necessaria per aiutare nell’autoassemblaggio delle particelle27. PEG migliora anche la stabilità di archiviazione degli LNP impedendo l’aggregazione. Inoltre, PEG è spesso usato come componente stealth e può aumentare il tempo di circolazione per gli LNP. Tuttavia, questo attributo può anche porre sfide per il reclutamento di LNP negli epatociti attraverso un meccanismo di targeting endogeno guidato dall’apolipoproteina E (ApoE)28. Pertanto, gli studi hanno studiato la lunghezza della catena acilico per la diffusione del PEG dall’LNP, scoprendo che le lunghezze corte (C8-14) si dissociano dall’LNP e sono più suscettibili al reclutamento di ApoE rispetto alle lunghezze acilice più lunghe28. Inoltre, il grado di saturazione della coda lipidica a cui PEG è coniugato ha dimostrato di influenzare la distribuzione tissutale di LNP29. Recentemente, Tween 20, che è un tensioattivo comunemente usato nelle formulazioni di farmaci biologici e ha una lunga coda lipidica insatura, ha dimostrato di avere un’elevata trasfezione nei linfonodi drenanti rispetto a PEG-DSPE, che ha in gran parte trasfettato il muscolo nel sito di iniezione29. Questo parametro può essere ottimizzato per ottenere la biodistribuzione LNP desiderata.
I metodi convenzionali di formazione degli LNP includono il metodo di idratazione a film sottile e il metodo di iniezione di etanolo27. Mentre queste sono tecniche prontamente disponibili, sono anche ad alta intensità di lavoro, possono comportare una bassa efficienza di incapsulamento e sono difficili da scalare fino a27. I progressi nelle tecniche di miscelazione hanno portato a metodi più suscettibili di scalare, mentre sviluppano particelle più uniformi27. Questi metodi includono la miscelazione a giunzione T, la miscelazione a spina di pesce sfalsata e la messa a fuoco idrodinamica microfluidica27. Ogni metodo ha una struttura unica, ma tutti consentono una rapida miscelazione di una fase acquosa contenente l’acido nucleico con una fase organica contenente i componenti lipidici, con conseguente elevato incapsulamento dell’acido nucleico27. In questo protocollo, viene utilizzata una miscelazione rapida e controllata attraverso una cartuccia microfluidica, che impiega il design di miscelazione a spina di pesce sfalsato. Questo protocollo delinea la preparazione, l’assemblaggio e la caratterizzazione dell’acido nucleico contenente LNP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riproducibilità, velocità e screening a basso volume sono vantaggi significativi dell’utilizzo della miscelazione microfluidica per formare LNP rispetto ad altri metodi esistenti (ad esempio, idratazione del film lipidico e iniezione di etanolo). Abbiamo dimostrato la riproducibilità di questo metodo senza alcun impatto sull’efficienza di incapsulamento o sulla dimensione delle particelle osservate con diversi lotti LNP. Questo è un criterio essenziale affinché qualsiasi terapia, compresi gli LNP, diventi clinicamen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grazie ad Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger e Philip Zakas per la loro guida e il loro contributo allo sviluppo di LNP.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
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