지질 나노 입자는 mRNA 및 DNA 캡슐화를 위한 미세유체 혼합 플랫폼 접근 방식을 사용하여 개발됩니다.
지질 기반 의약품 운반대는 작은 크기, 생체 적합성 및 높은 캡슐화 효율로 인해 임상 및 시판 가능한 전달 시스템에 사용되어 왔습니다. 지질 나노 입자 (LP)를 사용하여 핵산을 캡슐화하는 것은 RNA 또는 DNA를 저하로부터 보호하는 동시에 세포 섭취를 촉진하는 데 유리하다. LP는 종종 이온화 지질, 도우미 지질, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 공액 지질을 포함한 여러 지질 성분을 포함한다. LP는 이온화성 지질 존재로 인해 핵산을 쉽게 캡슐화할 수 있으며, 이는 낮은 pH에서 양이온이며 음전하 RNA 또는 DNA로 복합화를 허용합니다. 여기서 LPPs는 수성 상에서 지질 성분의 신속한 혼합을 사용하여 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 캡슐화함으로써 형성된다. 이 혼합은 정밀한 미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 수행되므로 라미나르 흐름을 유지하면서 나노 입자 자체 조립을 허용합니다. 유체역학적 크기와 다분산성은 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 측정됩니다. LNP의 유효 표면 전하는 제타 전위를 측정하여 결정됩니다. 캡슐화 효율은 힌지된 핵산을 정량화하기 위해 형광염을 사용하는 것이 특징입니다. 대표적인 결과는 이 방법의 재현성과 상이한 제형 및 공정 파라미터가 개발된 LNP에 미치는 영향을 입증한다.
약물 운반대는 낮은 세포 독성, 생체 이용률 증가 및 향상된 안정성1,2,3을포함한 전형적인 유리한 특성을 가진치료법을보호하고 전달하는 데 사용됩니다. 중합체 나노 입자, 미셀 및 지질 계 입자는 이전에 핵산 캡슐화 및전달을위해 탐구되었다4,5,6,7. 지질은 고안정성8과생체 적합성이기 때문에 지질및 지질 나노입자를 포함한 다양한 유형의 나노캐리어 시스템에서 사용되어 왔다. LP는 유전자전달9,10을위해 핵산을 쉽게 캡슐화할 수 있다. 그들은 전신 순환(11) 동안 혈청 프로테아제에 의한 분해로부터 핵산을 보호하고 LP의 표면 지형 및 물리적 특성이 그들의 생체분포에영향을 미치기 때문에 특정 부위에 대한 전달을 향상시킬 수 있다. LP는 또한 조직 침투 및 세포 섭취를 향상9. 이전 연구는 2018년 미국 식품의약국(FDA)과 유럽의약품청에서 승인한 유전성 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증14 치료의 치료 다신경병증치료제를 함유한 최초의 상용 LNP를 포함하여 LNP13내에서 siRNA 캡슐화의 성공을 입증하였다. 최근에는 LNPs가 더 큰 핵산 모이티, 즉 mRNA 및 DNA9의전달을 위해 연구되고 있다. 2018년 현재, 22개의 지질계 핵산 전달 시스템이임상시험(14)을겪고 있었다. 또한, LP를 함유하는 mRNA는 현재 주요 후보이며 COVID-19 백신15,16에채용되었다. 이러한 비 바이러스 유전자 치료에 대한 잠재적 인 성공은 작은 형성을 필요로 (~100 nm), 안정적이고 핵산의 높은 캡슐화와 균일 한 입자.
LNP 제형의 주성분으로서 이온화지질을 사용하는 것은 복합성, 캡슐화 및 전달효율(14)에대한 이점을 보여주었다. 이온화지질은 전형적으로 산성 해리 상수(pKa) < 7을 가지며; 예를 들어, 딜리놀레틸메틸-4-디메틸아미노부티레이트(D-Lin-MC3-DMA)는 FDA 승인 LNP 제형에 사용되는 이온화지질6.4417의pKa를 가지고 있다. 낮은 pH에서, 이온화 지질에 아민 그룹은 양성되고 긍정적으로 충전되어 mRNA 및 DNA에 음전하 인산염 그룹으로 조립할 수 있게 합니다. 아민의 비율, “N”, 인산염에 대한 그룹, “P”, 그룹은 조립을 최적화하는 데 사용된다. N/P 비는 사용되는 지질 및 핵산에 의존하며, 이는제형(18)에따라 다릅니다. 형성 후, pH는 치료 적 투여를 허용하기 위해 중성 또는 생리적 pH로 조절될 수 있다. 이러한 pH 값에서, 이온화지질은 또한 LNP에 중립 표면 전하를 부여하는 데프로톤화된다.
이온화지질은 또한 내피 탈출19,20에도움이 됩니다. LP는 세포 섭취 중 내분비증을 겪고핵(21)에세포 질 또는 DNA 화물을 세포 세포질 또는 DNA 화물로 전달하기 위해 내성에서 방출되어야 한다. 내분 내부는 전형적으로 세포외 배지보다 더 산성환경이며, 이는 이온화지질을 양산하22,23로렌더링한다. 양전하 이온지질은 내피 지질 막에 대한 음전하와 상호 작용할 수 있으며, 이는 LNP 및 핵산의 방출을 허용하는 내종의 불안정을 유발할 수 있다. 다른 이온화지질은 현재 LNP 분포의 효능을 향상시키기 위해 연구되고 있으며, 내도탈출(14).
LNP의 그밖 전형적인 분대는 인산염 (PC) 또는 인포에탄올라민 (PE) 지질과 같은 도우미 지질을 포함합니다. 1,2-Dioleoyl-sn-글리세로-3-인포에탄탄민(DOPE), 1,2-디스테로일-센-글리세로-3-인포콜린(DSPC), 및 1,2-2-디오레오틸-센-글리세로-3-인포콜린(DOPC)은 일반적으로 사용되며,24. DOPE는 반전 된 육각형 II (HII) 위상을 형성하고 멤브레인 융합(26)에의한 형질을 향상시키는 것으로 나타났으며, DSPC는 원통형 기하학적기하학적 인 27로LP를 안정화시키는 것으로 생각되고 있다. 콜레스테롤은 또한 막 강성을 증가시키기 위하여 제형에 통합되고, 그 후에 LNP의 안정성을 돕습니다. 마지막으로, 지질-공주 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 입자 자가조립(27)을돕는 데 필요한 스테릭 장벽을 제공하는 제형에 포함된다. PEG는 또한 집계를 방지하여 LP의 스토리지 안정성을 향상시킵니다. 또한 PEG는 종종 스텔스 성분으로 사용되며 LP의 순환 시간을 증가시킬 수 있습니다. 그러나, 이 속성은 또한 apolipoprotein E (ApoE)28에의해 구동되는 내인성 표적 화기 장치를 통해 간구에 LP의 모집에 대한 도전을 제기할 수 있다. 따라서, 연구는 LNP에서 PEG의 확산에 대한 아실 사슬 길이를 조사하고, 짧은 길이 (C8-14) LNP에서 해리하고 더 긴 아실 길이에 비해 ApoE 모집에 더 순종발견28. 또한, PEG가 공주되는 지질꼬리의 포화정도는LP(29)의조직 분포에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 최근에는 생물학적 약물 제품 제형에 일반적으로 사용되는 계면활성제이고 오랫동안 불포화지질꼬리를 가진 트위엔(20)은 주사부위(29)에서근육을 크게 감염시킨 PEG-DSPE에 비해 림프절배수에 높은 트랜스페션을 갖는 것으로 나타났다. 이 매개 변수는 원하는 LNP 바이오 분배를 달성하기 위해 최적화 될 수있다.
종래의 LP 성형 방법은 박막 수화 방법 및 에탄올 주입방법(27)을포함한다. 이들은 쉽게 사용할 수있는 기술이지만, 그들은 또한 노동 집약적이며, 낮은 캡슐화 효율을 초래할 수 있으며,27을확장하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 혼합 기술의 발전으로 인해 더 균일한입자(27)를개발하면서 확장할 수 있는 방법이 더 많아졌다. 이러한 방법에는 T-접합 혼합, 비틀거림 헤링본 혼합, 및 미세 유체 유체 유체 역학초점(27)이 포함됩니다. 각 방법은 독특한 구조를 가지고 있지만, 모두 지질 성분을 함유하는 유기상으로 핵산을 함유하는 수상의 신속한 혼합을 허용하여핵산(27)의높은 캡슐화를 초래한다. 이 프로토콜에서는 미세 유체 카트리지를 통한 신속하고 제어된 혼합이 사용되며, 이는 비틀거리는 헤링본 혼합 설계를 사용합니다. 이 프로토콜은 LP를 포함하는 핵산의 준비, 조립 및 특성화를 간략하게 설명합니다.
재현성, 속도 및 저부피 스크리닝은 다른 기존 방법(예: 지질 필름 수화 및 에탄올 주입)에 비해 LP를 형성하기 위해 미세유체 혼합을 사용하는 데 상당한 이점이 있습니다. 우리는 다른 LNP 배치로 관찰 된 캡슐화 효율이나 입자 크기에 영향을 미치지 않고이 방법의 재현성을 입증했습니다. 이것은 LP를 포함하여 어떤 치료든지, 임상적으로 유효하게 하기 위한 필수적인 기준입니다.
<p class="jove_co…The authors have nothing to disclose.
아툴 살루자, 야틴 고칸, 마리아 테레사 페라키아, 월터 슈벵거, 필립 자카스가 LNP 개발에 대한 지도와 공헌에 감사드립니다.
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
Zetasizer Nano | Malvern |