Formulando e caracterizando nanopartículas lipídicas para entrega de genes usando uma plataforma de mistura microfluida
Summary
As nanopartículas lipídicas são desenvolvidas usando uma abordagem de plataforma de mistura microfluida para encapsulamento de mRNA e DNA.
Abstract
Os portadores de medicamentos à base de lipídio têm sido usados para sistemas de entrega clinicamente e comercialmente disponíveis devido ao seu pequeno tamanho, biocompatibilidade e alta eficiência de encapsulamento. O uso de nanopartículas lipídicas (LNPs) para encapsular ácidos nucleicos é vantajoso para proteger o RNA ou DNA da degradação, ao mesmo tempo em que promove a absorção celular. Os LNPs geralmente contêm múltiplos componentes lipídesis, incluindo um lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol e lipídio conjugado de polietileno glicol (PEG). Os LNPs podem facilmente encapsular ácidos nucleicos devido à presença lipídica ionizável, que em pH baixo é cationic e permite a complexação com RNA ou DNA carregados negativamente. Aqui os LNPs são formados por encapsular o RNA mensageiro (mRNA) ou DNA plasmídeo (pDNA) usando a mistura rápida dos componentes lipídicos em uma fase orgânica e o componente ácido nucleico em uma fase aquosa. Esta mistura é realizada usando uma plataforma de mistura microfluida precisa, permitindo a automontagem de nanopartículas enquanto mantém o fluxo laminar. O tamanho hidrodinâmico e a polidispersidade são medidos usando dispersão dinâmica de luz (DLS). A carga de superfície eficaz no LNP é determinada medindo o potencial zeta. A eficiência de encapsulamento é caracterizada usando um corante fluorescente para quantificar o ácido nucleico preso. Os resultados representativos demonstram a reprodutibilidade deste método e a influência que diferentes formulações e parâmetros de processo têm sobre as LNPs desenvolvidas.
Introduction
Os portadores de drogas são usados para proteger e fornecer um terapêutico com propriedades favoráveis típicas, incluindo baixa citotoxicidade, aumento da biodisponibilidade e melhor estabilidade1,2,3. Nanopartículas poliméricas, micelas e partículas à base de lipídios foram previamente exploradas para encapsulamento e entrega de ácido nucleico4,5,6,7. Lipídios têm sido usados em diferentes tipos de sistemas de nanocarrier, incluindo lipossomos e nanopartículas lipídicas, pois são biocompatíveis com alta estabilidade8. Os LNPs podem facilmente encapsular ácidos nucleicos para a entrega de genes9,10. Protegem o ácido nucleico da degradação por proteases soro durante a circulação sistêmica11 e podem melhorar a entrega para locais específicos, pois a topografia superficial e as propriedades físicas dos LNPs influenciam sua biodistribução12. Os LNPs também melhoram a penetração de tecidos e a captação celular9. Estudos anteriores demonstraram o sucesso do encapsulamento do siRNA dentro de um LNP13, incluindo o primeiro LNP comercialmente disponível contendo siRNA terapêutico para o tratamento de poneuropatia de tratamento de amilidação mediada por transtoretinahereditária 14 tratamento que foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos e pela Agência Europeia de Medicamentos em 2018. Mais recentemente, lNPs estão sendo estudados para a entrega de maiores moieties de ácido nucleico, ou seja, mRNA e DNA9. Em 2018, havia ~ 22 sistemas de entrega de ácido nucleico à base de lipídios submetidos a testes clínicos14. Além disso, o mRNA contendo LNPs são atualmente os principais candidatos e foram empregados para uma vacina COVID-1915,16. O potencial sucesso dessas terapias genéticas não virais requer a formação de partículas pequenas (~100 nm), estáveis e uniformes com alto encapsulamento do ácido nucleico.
O uso de um lipídio ionizável como componente principal na formulação do LNP tem mostrado vantagens para a complexidade, encapsulamento e effciciency de entrega14. Lipídios ionizáveis normalmente têm uma constante de dissociação de ácido (pKa) < 7; por exemplo, dilinoleylmeethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), o lipídio ionizável usado na formulação lnp aprovada pela FDA, tem um pKa de 6.4417. No pH baixo, os grupos de amina no lipídio ionizável tornam-se protoados e carregados positivamente, permitindo a montagem com grupos de fosfato carregados negativamente no mRNA e DNA. A razão de amina, “N”, grupos para fosfato, “P”, grupos é usado para otimizar a montagem. A razão N/P depende dos lipídios e ácidos nucleicos utilizados, que varia dependendo da formulação18. Após a formação, o pH pode ser ajustado a um pH neutro ou fisiológico para permitir a administração terapêutica. A esses valores de pH, o lipídio ionizável também é desprotoado que dá carga de superfície neutra ao LNP.
O lipídio ionizável também auxilia na fuga endossomal19,20. Os LNPs são submetidos à endocitose durante a captação celular e devem ser liberados do endosomhei para entregar a carga de mRNA no citoplasma celular ou carga de DNA para o núcleo21. Dentro do endosomho é tipicamente um ambiente mais ácido do que o meio extracelular, o que torna o lipídio ionizável carregado positivamente22,23. O lipídio ionizável carregado positivamente pode interagir com cargas negativas na membrana lipídica endossomal, o que pode causar desestabilização do endóssomo permitindo a liberação do LNP e do ácido nucleico. Diferentes lipídios ionizáveis estão sendo estudados para melhorar a eficácia tanto da distribuição do LNP, quanto para a fuga endossomal14.
Outros componentes típicos de um LNP incluem lipídios auxiliares, como um lipídio fosfatidylcholina (PC) ou fosfoetanolamina (PE). 1,2-Dioleoyl-sn -gliceo-3-fosfoethanolamina (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phos a foforolina (DSPC) e 1,2-dioleoyl-sn-gliceo-3-fosfocholina (DOPC) são lipídios auxiliares comumente usados24,25. A DOPE tem sido demonstrada para formar uma fase hexagonal ii invertida (HII) e melhorar a transfecção por fusão de membrana26,enquanto o DSPC foi pensado para estabilizar LNPs com sua geometria cilíndrica27. O colesterol também é incorporado na formulação, a fim de aumentar a rigidez da membrana, auxiliando posteriormente na estabilidade do LNP. Finalmente, o polietileno glicol conjugado lipídida (PEG) é incluído na formulação para fornecer a barreira estérica necessária para auxiliar na automontagem de partículas27. A PEG também melhora a estabilidade de armazenamento dos LNPs, impedindo a agregação. Além disso, o PEG é frequentemente usado como um componente furtivo e pode aumentar o tempo de circulação para os LNPs. No entanto, esse atributo também pode representar desafios para o recrutamento de LNPs para hepatócitos através de um mecanismo de segmentação endógeno impulsionado pela apolipoproteína E (ApoE)28. Assim, estudos têm investigado o comprimento da cadeia aciola para difusão de PEG do LNP, descobrindo que os comprimentos curtos (C8-14) se dissociam do LNP e são mais favoráveis ao recrutamento de ApoE em comparação com comprimentos de acicl mais longos28. Além disso, o grau de saturação da cauda lipídica a que o PEG é conjugado tem sido demonstrado para influenciar a distribuição tecidual de LNPs29. Recentemente, o Tween 20, que é um surfactante comumente usado em formulações de produtos biológicos de medicamentos e tem uma longa cauda lipídica insaturada, mostrou-se ter alta transfecção na drenagem de linfonodos em comparação com peg-DSPE, que transfetou em grande parte o músculo no local da injeção29. Este parâmetro pode ser otimizado para alcançar a biodistribução desejada do LNP.
Os métodos convencionais de formação de LNPs incluem o método de hidratação de filme fino e o método de injeção de etanol27. Embora estas sejam técnicas prontamente disponíveis, elas também são intensivas em mão-de-obra, podem resultar em baixa eficiência de encapsulamento e são desafiadoras para escalar27. Os avanços nas técnicas de mistura resultaram em métodos mais favoráveis à escala, ao mesmo tempo em que desenvolvem partículas mais uniformes27. Estes métodos incluem mistura de junção T, mistura de herringbone escalonado e foco hidrodinâmico microfluidic27. Cada método possui uma estrutura única, mas todos permitem a rápida mistura de uma fase aquosa contendo o ácido nucleico com uma fase orgânica contendo os componentes lipídicos, resultando em alto encapsulamento do ácido nucleico27. Neste protocolo é utilizada a mistura rápida e controlada através de um cartucho microfluido, que emprega o design de mistura de herringbone escalonado. Este protocolo descreve a preparação, montagem e caracterização do ácido nucleico contendo LNPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
A reprodutibilidade, a velocidade e a triagem de baixo volume são vantagens significativas do uso da mistura microfluida para formar LNPs em comparação com outros métodos existentes (por exemplo, hidratação de filme lipídico e injeção de etanol). Demonstramos a reprodutibilidade deste método sem impacto na eficiência de encapsulamento ou tamanho de partículas observada com diferentes lotes de LNP. Este é um critério essencial para que qualquer terapêutico, incluindo os LNPs, se torne clinicamente disponív…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Obrigado a Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger e Philip Zakas por suas orientações e contribuições para o desenvolvimento do LNP.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
References
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
- Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
- Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
- Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
- Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
- Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
- Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
- Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
- Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
- Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
- Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
- Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
- Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
- Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
- Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
- Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
- Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
- Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
- Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
- Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
- Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
- NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020)
- Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
- Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
- Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).
