माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके जीन डिलीवरी के लिए लिपिड नैनोकणों को तैयार करना और उनकी विशेषता करना
Summary
लिपिड नैनोकणों को एमआरएनए और डीएनए एनकैप्सुलेशन के लिए माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग प्लेटफॉर्म दृष्टिकोण का उपयोग करके विकसित किया जाता है।
Abstract
लिपिड आधारित दवा वाहकों का उपयोग उनके छोटे आकार, जैव अनुकूलता और उच्च एनकैप्सुलेशन दक्षता के कारण चिकित्सकीय और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वितरण प्रणालियों के लिए किया गया है। न्यूक्लिक एसिड को समाहित करने के लिए लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) का उपयोग आरएनए या डीएनए को गिरावट से बचाने के लिए लाभप्रद है, जबकि सेलुलर तेज को भी बढ़ावा देता है। एलएनपी में अक्सर एक आयनित लिपिड, सहायक लिपिड, कोलेस्ट्रॉल और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) संयुग्मित लिपिड सहित कई लिपिड घटक होते हैं। एलएनपी आयनित लिपिड उपस्थिति के कारण न्यूक्लिक एसिड को आसानी से समाहित कर सकता है, जो कम पीएच पर cationic है और नकारात्मक रूप से चार्ज आरएनए या डीएनए के साथ जटिलता के लिए अनुमति देता है। यहां एलएनपी एक कार्बनिक चरण में लिपिड घटकों के तेजी से मिश्रण और एक जलीय चरण में न्यूक्लिक एसिड घटक का उपयोग करके मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) या प्लाज्मिड डीएनए (पीडीएनए) को एनकैप्सुलेट करके बनते हैं। यह मिश्रण एक सटीक माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण मंच का उपयोग करके किया जाता है, जो लैमिनार प्रवाह को बनाए रखते हुए नैनोपार्टिकल सेल्फ-असेंबली की अनुमति देता है। हाइड्रोडायनामिक आकार और पॉलीडिस्पर्सिटी को डायनेमिक लाइट स्कैटरिंग (डीएलएस) का उपयोग करके मापा जाता है। एलएनपी पर प्रभावी सतह प्रभारी जीटा क्षमता को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। एनकैप्सुलेशन दक्षता को फ्लोरसेंट डाई का उपयोग करके फंसाए गए न्यूक्लिक एसिड की मात्रा निर्धारित करने के लिए विशेषता है। प्रतिनिधि परिणाम इस विधि की पुनरुत्पादनता और विकसित एलएनपी पर विभिन्न निर्माण और प्रक्रिया मापदंडों के प्रभाव को प्रदर्शित करते हैं।
Introduction
दवा वाहकों का उपयोग कम साइटोटॉक्सीसिटी, जैव उपलब्धता में वृद्धि औरबेहतरस्थिरता 1, 2, 3सहित विशिष्ट अनुकूल गुणों के साथ चिकित्सीय की रक्षा और वितरित करने के लिए कियाजाताहै। पॉलीमेरिक नैनोकणों, माइकल्स और लिपिड आधारित कणों को पहले न्यूक्लिक एसिड एनकैप्सुलेशन और डिलीवरी4, 5,6,7के लिए खोजा गया है। लिपिड का उपयोग विभिन्न प्रकार के नैनोकैरियर प्रणालियों में किया गया है, जिनमें लिपोसोम और लिपिड नैनोकण शामिल हैं, क्योंकि वे उच्चस्थिरता 8के साथ जैव संगत हैं। एलएनपी जीन डिलीवरी9,10के लिए न्यूक्लिक एसिड को आसानी से समाहित कर सकता है । वे प्रणालीगत परिसंचरण11 के दौरान सीरम प्रोटीज द्वारा नाभिक एसिड को गिरावट से बचाते हैं और विशिष्ट साइटों को वितरण में सुधार कर सकते हैं, क्योंकि एलएनपी की सतह स्थलाकृति और भौतिक गुण उनके बायोडिलिएब्यूशन12को प्रभावित करते हैं। एलएनपी भी ऊतक प्रवेश और सेलुलर तेज9में सुधार । पिछले अध्ययनों ने एलएनपी13के भीतर सिरना एनकैप्सुलेशन की सफलता का प्रदर्शन किया है, जिसमें पहले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलएनपी शामिल हैं, जिसमें वंशानुगत ट्रांसथाइरेटिन-मध्यस्थता एमिलॉयडोसिस14 उपचार के उपचार पॉलीन्यूरोपैथी के लिए सिरर्ना चिकित्सीय शामिल है जिसे संयुक्त राज्य अमेरिका खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) और यूरोपीय दवाओं की एजेंसी द्वारा 2018 में अनुमोदित किया गया था। हाल ही में, बड़े न्यूक्लिक एसिड मोइलिएजियों, अर्थात् एमआरएनए और डीएनए9के वितरण के लिए एलएनपी का अध्ययन किया जा रहा है। 2018 तक, नैदानिक परीक्षणों के दौर से गुजर रहे ~ 22 लिपिड-आधारित न्यूक्लिक एसिड डिलीवरी सिस्टमथे। इसके अतिरिक्त, एलएनपी युक्त एमआरएनए वर्तमान में उम्मीदवारों का नेतृत्व कर रहे हैं और उन्हें COVID-19 वैक्सीन15, 16के लिएनियोजितकिया गया है। इन गैर वायरल जीन चिकित्सा के लिए संभावित सफलता के लिए छोटे (~ 100 एनएम), स्थिर, और न्यूक्लिक एसिड के उच्च encapsulation के साथ समान कणों के गठन की आवश्यकता है।
एलएनपी फॉर्मूलेशन में एक मुख्य घटक के रूप में एक आयनित लिपिड का उपयोग जटिलता, एनकैप्सुलेशन और डिलीवरी एफिलिएंसी14के लिए फायदे दिखाए गए हैं। आयनिज्य लिपिड में आमतौर पर 7 < एक एसिड वियोजन स्थिर (पीकेए) होता है; उदाहरण के लिए, एफडीए अनुमोदित एलएनपी फॉर्मूलेशन में उपयोग किए जाने वाले आयनीकृत लिपिड में 6.44 17 का एक पीकेए है, डिनोलेलेमेमेथाइल-4-डाइमेथिलमिनोब्यूटिरेट (डी-लिन-एमसी3-डीएमए), 6.4417का एक पीसीए है। कम पीएच पर, आयनिज्य लिपिड पर अमीन समूह प्रोटोनेटेड और सकारात्मक रूप से चार्ज हो जाते हैं, जिससे एमआरएनए और डीएनए पर नकारात्मक रूप से चार्ज फॉस्फेट समूहों के साथ असेंबली के लिए अनुमति मिलती है। अमीन का अनुपात, “एन”, समूहों को फॉस्फेट, “पी”, समूहों का उपयोग असेंबली को अनुकूलित करने के लिए किया जाता है। एन/पी अनुपात लिपिड और न्यूक्लिक एसिड पर निर्भर करता है, जो फॉर्मूलेशन18के आधार पर बदलता रहता है । गठन के बाद, पीएच चिकित्सकीय प्रशासन के लिए अनुमति देने के लिए एक तटस्थ या शारीरिक पीएच के लिए समायोजित किया जा सकता है। इन पीएच मूल्यों पर, आयनज्जित लिपिड को भी कम किया जाता है जो एलएनपी को तटस्थ सतह प्रभार प्रदान करता है।
आयनजित लिपिड भी एंडोसोमल एस्केप19,20में एड्स करता है । एलएनपी को सेलुलर तेज के दौरान एंडोसाइटोसिस से गुजरना पड़ता है और एमआरएनए कार्गो को कोशिका साइटोप्लाज्म या डीएनए कार्गो में नाभिक21तक पहुंचाने के लिए एंडोसोम से छोड़ा जाना चाहिए । एंडोसोम के अंदर आमतौर पर बाह्य माध्यम की तुलना में अधिक अम्लीय वातावरण होता है, जो आयनजम्य लिपिड को सकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है22,23। सकारात्मक रूप से चार्ज आयनजी योग्य लिपिड एंडोसोम लिपिड झिल्ली पर नकारात्मक आरोपों के साथ बातचीत कर सकता है, जो एलएनपी और न्यूक्लिक एसिड की रिहाई के लिए अनुमति देने वाले एंडोसोम के अस्थिर हो सकते हैं। वर्तमान में एलएनपी वितरण दोनों की प्रभावकारिता में सुधार के साथ-साथ एंडोसोमल एस्केप14के लिए विभिन्न आयनित लिपिड का अध्ययन किया जा रहा है ।
एलएनपी के अन्य विशिष्ट घटकों में सहायक लिपिड शामिल हैं, जैसे कि फॉस्फेटिडिलकोलिन (पीसी) या फॉस्फोथेनोलामाइन (पीई) लिपिड। 1,2-डायोलियोल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोएनेलामाइन (डोप), 1,2-डिटेरोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीएसपीसी), और 1,2-डायोलियोल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीओपीसी) आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले लिपिड2425हैं। डोप को एक उल्टे षट्कोणीय द्वितीय (एचआईआई) चरण बनाने और झिल्ली संलयन26द्वारा ट्रांसफेक्शन को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, जबकि डीएसपीसी को अपनी बेलनाकार ज्यामिति27के साथ एलएनपी को स्थिर करने के लिए सोचा गया है । झिल्ली कठोरता को बढ़ाने के लिए कोलेस्ट्रॉल को निर्माण में भी शामिल किया जाता है, बाद में एलएनपी की स्थिरता में सहायता करता है। अंत में, लिपिड-संयुग्मित पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) को निर्माण में शामिल किया गया है ताकि कण आत्म-असेंबली27में सहायता के लिए आवश्यक स्टीरिक बाधा प्रदान की जा सके। खूंटी एकत्रीकरण को रोककर एलएनपी की भंडारण स्थिरता में भी सुधार करता है । इसके अलावा, खूंटी अक्सर एक चुपके घटक के रूप में प्रयोग किया जाता है और एलएनपी के लिए परिसंचरण समय बढ़ा सकते हैं। हालांकि, यह विशेषता एपोलीपोप्रोटीन ई (एपोई)28द्वारा संचालित एक अंतर्जात लक्ष्यीकरण तंत्र के माध्यम से हेपेटोसाइट्स को एलएनपी की भर्ती के लिए चुनौतियां भी पैदा कर सकती है। इस प्रकार, अध्ययनों ने एलएनपी से खूंटी के प्रसार के लिए एसील चेन लंबाई की जांच की है, यह पाते हुए कि एलएनपी से कम लंबाई (सी8-14) अलग हो जाती है और लंबे समय तक एसील लंबाई28की तुलना में एपोई भर्ती के लिए अधिक उत्तरदायी हैं। इसके अलावा, लिपिड पूंछ के संतृप्ति की डिग्री जिसे खूंटी को संयुग्मित किया गया है, एलएनपी29के ऊतक वितरण को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। हाल ही में, ट्वीन 20, जो जैविक दवा उत्पाद योगों में आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला एक लंबे समय से असंतृप्त लिपिड पूंछ है, को खूंटी-डीएसपीई की तुलना में लिम्फ नोड्स को निकालने में उच्च ट्रांसफेक्शन दिखाया गया था, जो काफी हद तक इंजेक्शन साइट29पर मांसपेशियों को संक्रमित करता है। वांछित एलएनपी बायोडिलिएब्यूशन प्राप्त करने के लिए इस पैरामीटर को अनुकूलित किया जा सकता है।
एलएनपी बनाने के पारंपरिक तरीकों में पतली फिल्म हाइड्रेशन विधि और इथेनॉल-इंजेक्शन विधि27शामिल हैं। हालांकि ये आसानी से उपलब्ध तकनीकें हैं, वे श्रम गहन भी हैं, जिसके परिणामस्वरूप कम एनकैप्सुलेशन दक्षता हो सकती है, और27को स्केल करना चुनौतीपूर्ण है। मिश्रण तकनीकों में प्रगति के परिणामस्वरूप अधिक समान कणों को विकसित करते हुए, स्केल करने के लिए अधिक उत्तरदायी तरीकेहुएहैं। इन तरीकों में टी-जंक्शन मिश्रण, कंपित हेरिंगबोन मिश्रण, और माइक्रोफ्लुइडिक हाइड्रोडायनामिक फोकसिंग27शामिल हैं। प्रत्येक विधि में एक अनूठी संरचना होती है, लेकिन सभी लिपिड घटकों वाले कार्बनिक चरण के साथ न्यूक्लिक एसिड युक्त जलीय चरण के तेजी से मिश्रण के लिए अनुमति देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप न्यूक्लिक एसिड27का उच्च एनकैप्सुलेशन होता है। इस प्रोटोकॉल में, माइक्रोफ्लुइडिक कारतूस के माध्यम से तेजी से और नियंत्रित मिश्रण का उपयोग किया जाता है, जो कंपित हेरिंगबोन मिश्रण डिजाइन को नियोजित करता है। यह प्रोटोकॉल एलएनपी युक्त न्यूक्लिक एसिड की तैयारी, असेंबली और लक्षण वर्णन को रेखांकित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रजनन, गति और कम मात्रा स्क्रीनिंग अन्य मौजूदा तरीकों (जैसे, लिपिड फिल्म हाइड्रेशन और इथेनॉल इंजेक्शन) की तुलना में एलएनपी बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण का उपयोग करने के महत्वपूर्ण फायदे हैं। ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एलएनपी विकास के प्रति उनके मार्गदर्शन और योगदान के लिए अतुल सलूजा, यतिन गोकरन, मारिया-टेरेसा पेराचिया, वाल्टर श्वेंगर और फिलिप जैकस को धन्यवाद ।
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
References
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
- Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
- Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
- Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
- Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
- Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
- Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
- Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
- Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
- Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
- Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
- Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
- Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
- Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
- Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
- Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
- Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
- Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
- Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
- Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
- Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
- NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020)
- Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
- Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
- Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).
