Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

Summary

Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.

Abstract

L’actine, le composant principal du cytosquelette, joue un rôle essentiel dans le maintien de la structure et de la fonction neuronales. Sous les états physiologiques, l’actine se présente en équilibre sous ses deux formes : globulaire monomère (G-actine) et filamenteuse polymérisée (F-actine). Aux bornes synaptiques, le cytosquelette d’actine forme la base des fonctions pré- et post-synaptiques critiques. De plus, les changements dynamiques dans le statut de polymérisation de l’actine (interconversion entre les formes globulaires et filamenteuses d’actine) sont étroitement liés aux altérations liées à la plasticité de la structure et de la fonction synaptiques. Nous rapportons ici une méthodologie basée sur la fluorescence modifiée pour évaluer le statut de polymérisation de l’actine dans des conditions ex vivo. Le test utilise de la phalloïde marquée par fluorescence, une phallotoxine qui se lie spécifiquement aux filaments d’actine (F-actine), fournissant une mesure directe de l’actine filamenteuse polymérisée. Comme preuve de principe, nous fournissons des preuves de la pertinence de l’essai à la fois dans les homogénats de tissu cérébral humain de rongeur et post mortem. En utilisant la latrunculinE A (un médicament qui dépolymérise les filaments d’actine), nous confirmons l’utilité du test dans la surveillance des altérations des niveaux de F-actine. De plus, nous étendons le dosage aux fractions biochimiques des terminaux synaptiques isolés dans lesquels nous confirmons une polymérisation accrue de l’actine lors de la stimulation par dépolarisation avec un K⁺extracellulaire élevé.

Introduction

L’actine protéique cytosquelettique est impliquée dans de multiples fonctions cellulaires, y compris le soutien structurel, le transport cellulaire, la motilité cellulaire et la division. L’actine se présente en équilibre sous deux formes : l’actine globulaire monomère (G-actine) et l’actine filamenteuse polymérisée (F-actine). Les changements rapides dans l’état de polymérisation de l’actine (interconversion entre ses formes G et F) entraînent un assemblage et un désassemblage rapides du filament et sous-tendent ses rôles régulateurs dans la physiologie cellulaire. L’actine forme le composant majeur de la structure cytosquelettique neuronale et influence un large éventail de fonctions neuronales^1,2. Il convient de noter que le cytosquelette d’actine fait partie intégrante de la plate-forme structurelle des terminaux synaptiques. En tant que tel, il est un déterminant majeur de la morphogenèse et de la physiologie synaptiques et joue un rôle fondamental dans le contrôle de la taille, du nombre et de la morphologie des synapses^3,4,5. En particulier, la polymérisation-dépolymérisation dynamique de l’actine est un déterminant clé du remodelage synaptique associé à la plasticité synaptique sous-jacente aux processus de mémoire et d’apprentissage. En effet, tant les fonctions présynaptiques (telles que la libération de neurotransmetteurs^6,7,8,9,10)que postynaptiques (remodelage dynamique lié à la plasticité^11,12,13,14)s’appuient de manière critique sur des changements dynamiques dans le statut de polymérisation du cytosquelette d’actine.

Dans des conditions physiologiques, les niveaux de F-actine sont régulés dynamiquement et étroitement par une voie multimodale impliquant une modification post-traductionnelle^4,15,16 ainsi que des protéines de liaison à l’actine (ABPs)^4,17. Les AOP peuvent influencer la dynamique de l’actine à plusieurs niveaux (tels que l’initiation ou l’inhibition de la polymérisation, l’induction de la ramification des filaments, la section des filaments en morceaux plus petits, la promotion de la dépolymérisation et la protection contre la dépolymérisation), et sont à leur tour sous un contrôle modulatoire rigoureux sensible à divers signaux extra- et intracellulaires^18,19,20. De tels contrôles de réglementation à plusieurs niveaux dictent une réglementation stricte de la dynamique d’actine au cytosquelette synaptique, en affinant les aspects pré- et postsynaptic de la physiologie neuronale à la fois aux états basiques et induits par l’activité.

Compte tenu des rôles importants de l’actine dans la physiologie neuronale, il n’est pas surprenant que plusieurs études aient fourni des preuves d’altérations de la dynamique de l’actine en tant qu’événements pathogènes critiques liés à un large éventail de troubles neurologiques, y compris la neurodégénérescence, les maladies psychologiques ainsi que les affections neurodéveloppementales^{3,21,22, 23,24, 25,26,27.} Malgré la richesse des données de recherche pointant vers des rôles clés de l’actine dans la physiologie neuronale et la physiopathologie, cependant, des lacunes importantes subsistent dans la compréhension de la dynamique de l’actine, en particulier au niveau du cytosquelette synaptique. D’autres études de recherche sont nécessaires pour avoir une meilleure compréhension de l’actine neuronale et de ses altérations dans des conditions pathologiques. L’un des principaux domaines d’intérêt dans ce contexte est l’évaluation de l’état de polymérisation de l’actine. Il existe des trousses commerciales occidentales à base de buvards (trousse biochimique d’essai in vivo de G-Actine/F-Actine; Cytosquelette SKU BK037^28,29) et des tests faits maison pour l’évaluation des niveaux de F-actine⁶. Cependant, parce que ceux-ci exigent l’isolement biochimique de la F-actine et de la G-actine et parce que leur quantification suivante est basée sur des protocoles d’immunoblotting, ils peuvent prendre du temps. Nous rapportons ci-dessus un dosage spectroscopie-basé sur la fluorescence adapté d’une étude précédente³⁰ avec des modifications qui peuvent être employées pour évaluer les deux niveaux basiques de F-actine, aussi bien que les changements dynamiques de son assemblage-démontage. Notamment, nous avons modifié efficacement le protocole original qui exige des échantillons adaptés à une cuvette de 1 mL au format actuel de plaque de 96 puits. Le protocole modifié a donc considérablement réduit la quantité de tissu/échantillon requise pour l’essai. De plus, nous fournissons des preuves que le protocole convient non seulement aux homogénats de tissu cérébral, mais également aux fractions subcellulaires telles que les terminaux synaptiques isolés (synaptosomes et synaptoneurosomes). Enfin, le test peut être utilisé pour les tissus cérébraux de rongeurs fraîchement disséqués et les échantillons de cerveau humain post mortem stockés à long terme. Il convient de noter que, bien que le test soit présenté dans un contexte neuronal, il peut être étendu de manière appropriée à d’autres types de cellules et processus physiologiques qui leur sont associés.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux règlements du Comité d’éthique de l’Université d’Otago sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (Protocole d’éthique No. AUP95/18 et AUP80/17) et le parlement néo-zélandais. Les tissus cérébraux humains ont été obtenus à partir de la banque de tissus neurologiques de la biobanque Clínic-IDIBAPS de l’hôpital de Barcelone, en Espagne. Tous les protocoles de prélèvement de tissus ont été approuvés par…

Representative Results

Linéarité du test pour l’évaluation des niveaux de F-actineTout d’abord, une courbe standard pour l’augmentation linéaire de la fluorescence de la phalloïde Alexa Fluor 647 a été établie et répétée pour chaque ensemble d’expériences(Figure 1). Pour étudier la plage linéaire de l’essai, différentes quantités d’homogénats cérébraux provenant de rongeurs(figures 2A et 2B)et de sujets humains post mortem<strong…

Discussion

Le dosage décrit ici, essentiellement adapté d’une étude précédente³⁰ avec des modifications, utilise une phallotoxine, la phalloïde marquée d’une étiquette fluorescente. Les analogues de la phalloïde fluorescente sont considérés comme l’étalon-or pour la coloration des filaments d’actine dans les tissus fixes^47,48,49. En fait, ce sont les outils les plus anciens pour identifier spéci…

Materials

3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube	Beckman Coulter	349622	For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287	F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH	Abcam	Ab181602	For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006	Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	4693159001	For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene	Corning	3596	For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)	Li-Cor Biosciences		For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II	Sigma-Aldrich	G6257	Fixative
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A	Sigma-Aldrich	L5163	Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670	Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm	Millipore	LSWP01300	Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate	Thermo Fisher Scientific	237105	For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm	Millipore	NY1H02500	Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV	Abcam	ab201115	For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL944	Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Krebs buffer component
SpectraMax i3x	Molecular Devices		For fluorometric measurements
Sucrose	Fisher Chemical	S/8600/60	Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder	Millipore	Sx0001300	Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem	Duran Wheaton Kimble	358034	For tissue homogenization
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Component of Permeabilization buffer
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066	Buffer ingredient for sample preparation