Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Summary

Relatamos um ensaio simples, eficiente e de alta produtividade baseado em espectroscopia de fluorescência para a quantificação de filamentos de actina em amostras biológicas ex vivo de tecidos cerebrais de roedores e seres humanos.

Abstract

Actin, o principal componente do citoesqueleto, desempenha um papel crítico na manutenção da estrutura e função neuronal. Nos estados fisiológicos, a actina ocorre em equilíbrio em suas duas formas: globular monomérica (G-actin) e fisordenos polimerizados (F- actina). Nos terminais sinápticos, o citoesqueleto de actin forma a base para funções críticas pré e pós-sináptica. Além disso, mudanças dinâmicas no status de polimerização da actina (interconversão entre formas globulares e relacionáveis de actina) estão intimamente ligadas a alterações relacionadas à plasticidade na estrutura e função sináptica. Informamos aqui uma metodologia baseada em fluorescência modificada para avaliar o status de polimerização da actina em condições ex vivo. O ensaio emprega fábulina fluorescentemente rotulada, uma falotoxina que se liga especificamente aos filamentos de actina (F-actin), fornecendo uma medida direta de ato de fiomatos polimerizados. Como prova de princípio, fornecemos evidências para a adequação do ensaio tanto em roedores quanto em homogeneizações de tecido cerebral humano pós-morte. Utilizando latrunculin A (uma droga que despomeriza filamentos de actina), confirmamos a utilidade do ensaio no monitoramento de alterações nos níveis de F-actin. Além disso, estendemos o ensaio a frações bioquímicas de terminais sinápticos isolados em que confirmamos o aumento da polimerização da actina após a estimulação por despolarização com alto K⁺extracelular .

Introduction

A actina de proteína citoesquelél está envolvida em múltiplas funções celulares, incluindo suporte estrutural, transporte celular, motilidade celular e divisão. A actina ocorre em equilíbrio em duas formas: actina globular monomérica (G-actin) e ato de fisordenada polimerizada (F-actin). Mudanças rápidas no status de polimerização da actina (interconversão entre suas formas G e F) resultam em rápida montagem de filamentos e desmontagem e fundamentam suas funções regulatórias na fisiologia celular. Actin forma o principal componente da estrutura citoesquelético neuronal e influencia uma ampla gama de funções neuronais^1,2. Note-se que o citoesqueleto actin forma parte integrante da plataforma estrutural dos terminais sinápticos. Como tal, é um dos principais determinantes da morfogênese sináptica e da fisiologia e desempenha um papel fundamental no controle do tamanho, número e morfologia das sinapses^3,4,5. Em particular, a polimerização dinâmica de actina-despomerização é um determinante fundamental da remodelagem sináptica associada à plasticidade sináptica subjacente aos processos de memória e aprendizagem. De fato, tanto as funções pressiná-iânfmáticas (como a liberação neurotransmissor^6,7,8,9,10) quanto as funções postsintálicas (remodelagem dinâmica relacionada à plasticidade^11,12,13,14) dependem criticamente de mudanças dinâmicas no status de polimerização do citoesqueleto actin.

Em condições fisiológicas, os níveis de F-actin são dinamicamente e firmemente regulados através de uma via multimodal envolvendo modificação pós-transacional^4,15,16, bem como proteínas de ligação de actina (ABPs)^4,17. Os ABPs podem influenciar a dinâmica da actina em vários níveis (como iniciar ou inibir a polimerização, induzir ramificações de filamentos, cortar filamentos em peças menores, promover a despomerização e proteger contra a despomerização), e estão em turno sob um rigoroso controle modulatório sensível a vários sinais extra e intracelular^18,19,20. Tais verificações regulatórias em vários níveis ditam uma regulação rigorosa da dinâmica da actina no citoesqueleto sináptico, afinando aspectos pré e postinopticos da fisiologia neuronal, tanto nos estados basais quanto induzidos pela atividade.

Dado os importantes papéis da actina na fisiologia neuronal, não é de surpreender que vários estudos tenham fornecido evidências de alterações na dinâmica da actina como eventos patogênicos críticos ligados a uma ampla gama de distúrbios neurológicos, incluindo neurodegeneração, doenças psicológicas e doenças neurodesenvolvimentares^{3,21,22,23,24,25,26,27}. Apesar da riqueza de dados de pesquisa que apontam para papéis-chave da actina na fisiologia neuronal e na fisiopatologia, no entanto, lacunas significativas ainda permanecem na compreensão da dinâmica da actina, particularmente no citoesqueleto sináptico. Mais estudos de pesquisa são necessários para ter uma melhor compreensão da actina neuronal e suas alterações em condições patológicas. Uma das principais áreas de foco nesse contexto é a avaliação do status de polimerização de actina. Existem kits comerciais baseados em manchas ocidentais (G-Actin/F-Actin in vivo assay bioquímico kit; Cytoskeleton SKU BK037^28,29) e ensaios caseiros para avaliação dos níveis de F-actin⁶. No entanto, como estes requerem isolamento bioquímico de F-actin e G-actin e porque sua quantificação subsequente é baseada em protocolos de imunobloquetação, eles podem ser demorados. Aqui relatamos um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência adaptado de um estudo anterior³⁰ com modificações que podem ser usadas para avaliar tanto os níveis basais de F-actin, como mudanças dinâmicas em sua montagem-desmontagem. Notavelmente, modificamos eficientemente o protocolo original que requer amostras adequadas para um cuvette de 1 mL para o formato atual de placa de 96 poços. O protocolo modificado reduziu significativamente a quantidade de tecido/amostra necessária para o ensaio. Além disso, fornecemos evidências de que o protocolo é adequado não apenas para homogeneizadores de tecido cerebral, mas também frações subcelulares, como terminais sinápticos isolados (sinápttos e sinápticos). Por fim, o ensaio pode ser empregado para tecidos cerebrais de roedores recém-dissecados e amostras cerebrais humanas pós-morte armazenadas a longo prazo. Note-se que, embora o ensaio seja apresentado em um contexto neuronal, ele pode ser adequadamente estendido a outros tipos de células e processos fisiológicos associados a eles.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as normas do Comitê de Ética da Universidade de Otago no Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Protocolo de Ética Nº. AUP95/18 e AUP80/17) e legislatura neozelandesa. Os tecidos cerebrais humanos foram obtidos do Neurological Tissue Bank of Hospital Clínic-IDIBAPS BioBank em Barcelona, Espanha. Todos os protocolos de coleta de tecidos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Clínic, em Barcelona, e o consentimento informado foi obtido…

Representative Results

Linearidade do ensaio para avaliação dos níveis de F-actinPrimeiro, foi verificada uma curva padrão para o aumento linear da fluorescência de Alexa Fluor 647 Phalloidin e repetida para cada conjunto de experimentos(Figura 1). Para investigar a faixa linear do ensaio, foram processadas diferentes quantidades de homogeneizadores cerebrais de roedores(Figuras 2A e 2B) e indivíduos humanos pós-morte(Figura 3A</str…

Discussion

O ensaio aqui descrito, essencialmente adaptado de um estudo anterior³⁰ com modificações, emprega uma falotoxina, phalloidina marcada com um rótulo fluorescente. Os análogos fluorescentes de faloidina são considerados o padrão-ouro para filamentos de actina de coloração em tecidos fixos^47,48,49. Na verdade, são as ferramentas mais antigas para identificar especificamente os filamentos<sup class="…

Materials

3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube	Beckman Coulter	349622	For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287	F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH	Abcam	Ab181602	For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006	Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	4693159001	For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene	Corning	3596	For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)	Li-Cor Biosciences		For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II	Sigma-Aldrich	G6257	Fixative
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A	Sigma-Aldrich	L5163	Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670	Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm	Millipore	LSWP01300	Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate	Thermo Fisher Scientific	237105	For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm	Millipore	NY1H02500	Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV	Abcam	ab201115	For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL944	Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Krebs buffer component
SpectraMax i3x	Molecular Devices		For fluorometric measurements
Sucrose	Fisher Chemical	S/8600/60	Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder	Millipore	Sx0001300	Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem	Duran Wheaton Kimble	358034	For tissue homogenization
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Component of Permeabilization buffer
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066	Buffer ingredient for sample preparation