JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Эффективный по времени анализ на основе флуоресцентной спектроскопии для оценки статуса полимеризации актина в тканях мозга грызунов и человека

Published: June 03, 2021
doi:
10.3791/62268
,
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences,University of Otago

Summary

Мы сообщаем о простом, эффективном по времени и высокопроизводительном флуоресцентном спектроскопии анализе для количественной оценки актиновых нитей в биологических образцах ex vivo из тканей мозга грызунов и людей.

Abstract

Актин, основной компонент цитоскелета, играет решающую роль в поддержании структуры и функции нейронов. При физиологических состояниях актин возникает в равновесии в двух его формах: мономерной глобулярной (G-актин) и полимеризованной нитевидной (F-актин). На синаптических терминалях актиновый цитоскелет образует основу для критических пре- и постсинаптических функций. Кроме того, динамические изменения в статусе полимеризации актина (взаимопревращение между глобулярной и нитевидной формами актина) тесно связаны с пластичными изменениями в синаптической структуре и функции. Здесь мы сообщаем о модифицированной методологии на основе флуоресценции для оценки статуса полимеризации актина в условиях ex vivo. В анализе используется флуоресцентно меченый фаллоидин, фаллотоксин, который специфически связывается с актиновыми нитями (F-актин), обеспечивая прямую меру полимеризованного нитевидного актина. В качестве принципиального доказательства мы предоставляем доказательства пригодности анализа как у грызунов, так и у гомогенатов ткани мозга человека. Используя латрункулин А (препарат, который деполимеризует актиновые нити), мы подтверждаем полезность анализа для мониторинга изменений уровня F-актина. Далее мы распространяем анализ на биохимические фракции изолированных синаптических терминалей, в которых мы подтверждаем повышенную полимеризацию актина при стимуляции деполяризацией с высоким внеклеточнымK+.

Introduction

Актин цитоскелетного белка участвует в нескольких клеточных функциях, включая структурную поддержку, клеточный транспорт, подвижность и деление клеток. Актин встречается в равновесии в двух формах: мономерный глобулярный актин (G-актин) и полимеризованный нитевидный актин (F-актин). Быстрые изменения в статусе полимеризации актина (взаимоконверсия между его G- и F-формами) приводят к быстрой сборке и разборке нитей и лежат в основе его регуляторных ролей в клеточной физиологии. Актин образует основной компонент нейрональной цитоскелетной структуры и влияет на широкий спектр нейронных функций1,2. Следует отметить, что актин цитоскелет является неотъемлемой частью структурной платформы синаптических терминалей. Таким образом, он является основным детерминантом синаптического морфогенеза и физиологии и играет фундаментальную роль в контроле размера, количества и морфологии синапсов3,4,5. В частности, динамическая полимеризация-деполимеризация актина является ключевым фактором, определяющим синаптическое ремоделирование, связанное с синаптической пластичностью, лежащей в основе процессов памяти и обучения. Действительно, как пресинаптические (такие как высвобождение нейромедиаторов6,7,8,9,10),так и постсинаптические функции (пластичность, связанная с динамическим ремоделированием11,12,13,14)критически полагаются на динамические изменения статуса полимеризации актинового цитоскелета.

В физиологических условиях уровни F-актина динамически и жестко регулируются через мультимодальный путь, включающий посттрансляционную модификацию4,15,16, а также актин-связывающие белки (ABP)4,17. ABP могут влиять на динамику актина на нескольких уровнях (таких как инициирование или ингибирование полимеризации, индуцирование ветвления нити, разрыв нитей на более мелкие кусочки, содействие деполимеризации и защита от деполимеризации) и, в свою очередь, находятся под строгим модулирующим контролем, чувствительным к различным вне- и внутриклеточным сигналам18,19,20. Такие регуляторные проверки на нескольких уровнях диктуют строгую регуляцию динамики актина в синаптическом цитоскелете, тонкую настройку пред- и постсинаптических аспектов физиологии нейронов как в базальном, так и в индуцированном активностью состояниях.

Учитывая важную роль актина в физиологии нейронов, неудивительно, что несколько исследований предоставили доказательства изменений в динамике актина как критических патогенных событий, связанных с широким спектром неврологических расстройств, включая нейродегенерацию, психологические заболевания, а также заболевания нервного развития3,21,22,23,24,25,26,27. Однако, несмотря на богатство исследовательских данных, указывающих на ключевую роль актина в физиологии нейронов и патофизиологии, в понимании динамики актина, особенно в синаптическом цитоскелете, все еще остаются значительные пробелы. Необходимы дополнительные исследования, чтобы лучше постить нейрональный актин и его изменения в патологических условиях. Одним из основных направлений деятельности в этом контексте является оценка статуса полимеризации актина. Существуют коммерческие наборы на основе вестерн-блоттинга (биохимический набор для анализа G-Actin/F-Actin in vivo; Цитоскелет SKU BK03728,29) и самодельные анализы для оценки уровня F-актина6. Однако, поскольку они требуют биохимической изоляции F-актина и G-актина и поскольку их последующая количественная оценка основана на протоколах иммуноблоттинга, они могут занять много времени. Здесь мы сообщаем об анализе на основе флуоресцентной спектроскопии, адаптированном из предыдущего исследования30 с модификациями, которые могут быть использованы для оценки как базальных уровней F-актина, так и динамических изменений в его сборке-разборке. Примечательно, что мы эффективно модифицировали оригинальный протокол, который требует образцов, подходящих для кюветы 1 мл, в текущем формате пластины с 96 скважинами. Таким образом, модифицированный протокол значительно уменьшил количество ткани/ образца, необходимое для анализа. Кроме того, мы предоставляем доказательства того, что протокол подходит не только для гомогенатов мозговой ткани, но и для субклеточных фракций, таких как изолированные синаптические терминали (синаптосомы и синаптоневросомы). Наконец, анализ может быть использован для свежепропарированных тканей мозга грызунов и длительно хранящихся посмертных образцов человеческого мозга. Следует отметить, что, хотя анализ представлен в нейронном контексте, он может быть соответствующим образом распространен на другие типы клеток и физиологические процессы, связанные с ними.

Protocol

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с регламентом Комитета по этике в уходе за лабораторными животными и их использовании Университетом Отаго (Ethics Protocol No. AUP95/18 и AUP80/17) и законодательный орган Новой Зеландии. Ткани головного мозга человека были получены из Банка …

Representative Results

Линейность анализа для оценки уровней F-актинаСначала была установлена стандартная кривая линейного увеличения флуоресценции фаллоидина Alexa Fluor 647, которая повторялась для каждой области экспериментов(рисунок 1). Для исследования линейного диапазона анализ?…

Discussion

Анализ, описанный здесь, по существу адаптированный из предыдущего исследования30 с модификациями, использует фаллотоксин, фаллоидин, помеченный флуоресцентной меткой. Флуоресцентные аналоги фаллоидина считаются золотым стандартом окрашивания актиновых нитей в фиксиро?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Неврологическим фондом Новой Зеландии (1835-PG), Новозеландским советом по исследованиям в области здравоохранения (#16-597) и кафедрой анатомии Университета Отаго, Новая Зеландия. Мы в долгу перед Банком неврологических тканей HCB-IDIBAPS BioBank (Испания) для тканей головного мозга человека. Мы благодарим Цзясянь Чжан за помощь в записи и редактировании видео.

Materials

3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer’s disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer’s disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer’s disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer’s Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer’s disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer’s disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer’s Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA – Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, 14869-14871 (2009).

Tags

ActinCytoskeletonF-actinG-actinPolymerizationFluorescence SpectroscopyPhalloidinSynaptic TerminalsSynaptosomesSynaptoneurosomesNeuropathologyNeuronal Physiology
check_url/62268?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues. J. Vis. Exp. (172), e62268, doi:10.3791/62268 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image