Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Summary

Relazioniamo un saggio semplice, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività a base di spettroscopia a fluorescenza per la quantificazione dei filamenti di actina in campioni biologici ex vivo provenienti da tessuti cerebrali di roditori e soggetti umani.

Abstract

Actin, la componente principale del citoscheletro, svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della struttura e della funzione neuronale. Sotto stati fisiologici, l’actina si verifica in equilibrio nelle sue due forme: globulare monomerico (G-actina) e filamentoso polimerizzato (F- actina). Ai terminali sinaptici, l’actina citoscheletro costituisce la base per le funzioni critiche pre e post-sinaptiche. Inoltre, i cambiamenti dinamici nello stato di polimerizzazione dell’actina (interconversione tra forme globulari e filamentose di actina) sono strettamente legati alle alterazioni legate alla plasticità nella struttura e nella funzione sinaptica. Qui riferiamo una metodologia modificata basata sulla fluorescenza per valutare lo stato di polimerizzazione dell’actina in condizioni ex vivo. Il saggio utilizza la phalloidina marcata fluorescentmente, una fllotoxina che si lega specificamente ai filamenti di actina (F-actin), fornendo una misura diretta dell’actina filamentosa polimerizzata. Come prova di principio, forniamo prove dell’idoneità del saggio sia negli omogeneati del tessuto cerebrale umano roditore che post mortem. Utilizzando latrunculinA A (un farmaco che depolimerizza i filamenti di actina), confermiamo l’utilità del saggio nel monitoraggio delle alterazioni nei livelli di F-actina. Inoltre, estendiamo il saggio alle frazioni biochimiche dei terminali sinaptici isolati in cui confermiamo una maggiore polimerizzazione dell’actina sulla stimolazione mediante depolarizzazione con K + extracellulare^elevato.

Introduction

L’actina della proteina citoscheletricha è coinvolta in molteplici funzioni cellulari, tra cui supporto strutturale, trasporto cellulare, motilità cellulare e divisione. L’actina si trova in equilibrio in due forme: actina globulare monomerica (G-actina) e actina filamentosa polimerizzata (F-actina). I rapidi cambiamenti nello stato di polimerizzazione dell’actina (interconversione tra le sue forme G e F) si traducono in un rapido assemblaggio e smontaggio dei filamenti e sono alla base dei suoi ruoli regolatori nella fisiologia cellulare. Actina forma il componente principale della struttura citoscheletricha neuronale e influenza una vasta gamma di funzioni neuronali^1,2. Da notare che l’actina citoscheletro forma parte integrante della piattaforma strutturale dei terminali sinaptici. Come tale, è un importante determinante della morfogenesi sinaptica e della fisiologia e svolge un ruolo fondamentale nel controllo delle dimensioni, del numero e della morfologia delle sinapsi^3,4,5. In particolare, l’actin polimerizzazione dinamica-depolimerizzazione è un fattore determinante del rimodellamento sinaptico associato alla plasticità sinaptica alla base dei processi di memoria e apprendimento. Infatti, sia le funzioni presnaptiche (come il rilascio di neurotrasmettitori^6,7,8,9,10) che le funzioni postsinaptiche (rimodellamento dinamico correlato alla plasticità^11,12,13,14)si basano criticamente su cambiamenti dinamici nello stato di polimerizzazione dell’actina citoscheletro.

In condizioni fisiologiche, i livelli di F-actina sono regolati dinamicamente e strettamente attraverso una via multimodale che comporta la modifica posttraslazionale^4,15,16 e proteine leganti l’actina (ARP)^4,17. Gli ARP possono influenzare la dinamica dell’actina a più livelli (come l’avvio o l’inibizione della polimerizzazione, l’induzione della ramificazione dei filamenti, la recidenza dei filamenti a pezzi più piccoli, la promozione della depolimerizzazione e la protezione dalla depolimerizzazione) e sono a loro volta sotto un rigoroso controllo modulatorio sensibile a vari segnali extra- e intracellulari^18,19,20. Tali controlli normativi a più livelli impongono una rigida regolazione della dinamica dell’actina nel citoscheletro sinaptico, per mettere a punto gli aspetti pre e postinaptici della fisiologia neuronale sia allo stato basale che indotto dall’attività.

Dati gli importanti ruoli dell’actina nella fisiologia neuronale, non sorprende che diversi studi abbiano fornito prove di alterazioni della dinamica dell’actina come eventi patogeni critici legati a una vasta gamma di disturbi neurologici tra cui neurodegenerazione, malattie psicologiche e disturbi del neurosviluppo^{3,21,22,23,24,25,26,27}. Nonostante la ricchezza di dati di ricerca che indicano ruoli chiave dell’actina nella fisiologia neuronale e nella fisiopatologia, tuttavia, permangono lacune significative nella comprensione delle dinamiche dell’actina, in particolare nel citoscheletro sinaptico. Sono necessari ulteriori studi di ricerca per avere una migliore comprensione dell’actina neuronale e delle sue alterazioni in condizioni patologiche. Una delle principali aree di interesse in questo contesto è la valutazione dello stato di polimerizzazione dell’actina. Esistono kit commerciali occidentali a base di gonfiore (kit biochimico di dosaggio G-Actin/F-Actin in vivo; Cytoskeleton SKU BK037^28,29) e saggi fatti in casa per la valutazione dei livelli di F-actin⁶. Tuttavia, poiché questi richiedono l’isolamento biochimico di F-actina e G-actina e poiché la loro successiva quantificazione si basa su protocolli di immunoblotting, possono richiedere molto tempo. Nel presente documento viene descritto un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza adattato da uno^{studio precedente 30} con modifiche che possono essere utilizzate per valutare sia i livelli basali di F-actina, sia i cambiamenti dinamici nel suo assemblaggio-smontaggio. In particolare, abbiamo modificato in modo efficiente il protocollo originale che richiede campioni adatti per una cuvetta da 1 mL all’attuale formato di piastra da 96 porti. Il protocollo modificato ha quindi ridotto significativamente la quantità di tessuto/campione richiesta per il saggio. Inoltre, forniamo prove che il protocollo è adatto non solo per gli omogeneati del tessuto cerebrale, ma anche per le frazioni subcellulari come terminali sinaptici isolati (sinaptosomi e sinaptoneurosomi). Infine, il saggio può essere utilizzato per tessuti cerebrali roditori appena sezionati e campioni cerebrali umani post mortem conservati a lungo termine. Da notare che, mentre il saggio è presentato in un contesto neuronale, può essere opportunamente esteso ad altri tipi di cellule e processi fisiologici ad essi associati.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state svolte in conformità con le normative del Comitato Etico dell’Università di Otago nella cura e nell’uso degli animali da laboratorio (Protocollo Etico n. AUP95/18 e AUP80/17) e legislatura neozelandese. I tessuti cerebrali umani sono stati ottenuti dalla Banca neurologica dei tessuti dell’ospedale Clínic-IDIBAPS BioBank di Barcellona, spagna. Tutti i protocolli di raccolta dei tessuti sono stati approvati dal Comitato Etico dell’Ospedale Clínic di Barcellona, e il consenso i…

Representative Results

Linearità del saggio per la valutazione dei livelli di F-actinIn primo luogo, è stata accertata una curva standard per l’aumento lineare della fluorescenza della fluorescenza di Alexa Fluor 647 Phalloidin ed è stata ripetuta per ogni seriedi esperimenti (figura 1). Per studiare la gamma lineare del saggio, sono state elaborate diverse quantità di omogeneati cerebrali provenienti dai roditori(figure 2A e 2B)e dai soggetti umani post …

Discussion

Il saggio qui descritto, essenzialmente adattato da uno^{studio precedente 30} con modifiche, utilizza una phallotoxin, la falloidina contrassegnata con un’etichetta fluorescente. Gli analoghi fluorescenti della falloidina sono considerati il gold standard per la colorazione dei filamenti di actina nei tessuti^{fissi 47,48,49}. In effetti, sono gli strumenti più antichi per identificare specificamente i filame…

Materials

3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube	Beckman Coulter	349622	For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287	F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH	Abcam	Ab181602	For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006	Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	4693159001	For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene	Corning	3596	For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)	Li-Cor Biosciences		For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II	Sigma-Aldrich	G6257	Fixative
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A	Sigma-Aldrich	L5163	Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670	Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm	Millipore	LSWP01300	Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate	Thermo Fisher Scientific	237105	For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm	Millipore	NY1H02500	Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV	Abcam	ab201115	For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL944	Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Krebs buffer component
SpectraMax i3x	Molecular Devices		For fluorometric measurements
Sucrose	Fisher Chemical	S/8600/60	Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder	Millipore	Sx0001300	Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem	Duran Wheaton Kimble	358034	For tissue homogenization
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Component of Permeabilization buffer
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066	Buffer ingredient for sample preparation