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Abstract
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Neuroscience

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

Published: June 03, 2021
doi:
10.3791/62268
,
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences,University of Otago

Summary

우리는 설치류와 인간 과목의 뇌 조직에서 전 생체 생물학적 샘플에서 actin 필라멘트의 정량화를위한 간단하고 시간 효율적이고 높은 처리량 형광 분광 기반 분석법을보고합니다.

Abstract

세포 골격의 주요 구성 요소인 액틴은 신경 구조와 기능의 유지 에 중요한 역할을 합니다. 생리학적 상태에서 액틴은 모황 구형(G-actin) 및 중합된 필라멘트(F-actin)의 두 가지 형태의 평형에서 발생합니다. 시냅스 단자에서 액틴 세포골격은 중요한 시냅스 기능의 기초를 형성합니다. 더욱이, 액틴 중합 상태의 동적 변화(구형 및 필라멘트 형태의 액틴 간의 상호 변환)는 시냅스 구조 및 기능의 가소성 관련 변화에 밀접하게 연관되어 있다. 우리는 여기에 전 생체 조건에서 actin의 중합 상태를 평가하기 위해 변형 된 형광 기반 방법론을보고합니다. 이 분석법은 형광라벨이 부착된 플라로이드인을 사용하며, 이는 특히 액틴 필라멘트(F-actin)에 결합하여 중합화된 필라멘트 액틴을 직접 측정합니다. 원칙의 증거로, 우리는 설치류와 사후 인간 뇌 조직 균질화분석의 적합성에 대한 증거를 제공합니다. 라트룬큘린 A(액틴 필라멘트를 비합한 약물)를 사용하여, 우리는 F-액틴 수준에서 변경을 모니터링하는 분석의 유용성을 확인합니다. 또한, 우리는 높은 세포외 K+를가진 탈극화에 의한 자극시 증가된 액틴 중합화를 확인하는 고립된 시냅스 말단의 생화학적 분획으로 분석법을 확장한다.

Introduction

Cytoskeletal 단백질 액틴은 구조적 지지, 세포 수송, 세포 운동성 및 분열을 포함한 다중 세포 기능에 관여합니다. 액틴은 단일황 구형 액틴(G-actin) 및 중합필액트액틴(F-actin)의 두 가지 형태로 평형에서 발생한다. actin의 중합 상태의 급속한 변화 (G-와 F-형태 간의 상호 변환)는 신속한 필라멘트 조립 및 분해를 초래하고 세포 생리학에서 의 규제 역할을 기초로합니다. 액틴은 뉴런 사이토켈레탈 구조의 주요 성분을 형성하고 광범위한 뉴런 기능1,2에영향을 미친다. 참고로, 액틴 세포골격은 시냅스 단자의 구조 플랫폼의 필수적인 부분을 형성한다. 이와 같이, 시냅스 형태발생 및 생리학의 주요 결정자이며 시냅스3,4,5의크기, 수 및 형태에 대한 제어에 근본적인 역할을 한다. 특히, 동적 액틴 중합-중합제는 기억 및 학습 과정의 근간이 되는 시냅스 가소성과 관련된 시냅스 리모델링의 핵심 결정자이다. 실제로, 두 사전 시냅스(예:신경 전달물질 방출6,7,8,9,10)및 포스트냅스 기능(가소성 관련 동적 리모델링11,12,13,14)액틴 사이토스켈레톤의 중합 상태의 동적 변화에 비판적으로 의존한다.

생리학적 조건하에서, F-actin 수준은 번역 후 변형4,15,16뿐만 아니라 액틴결합 단백질(ABP)4,17을포함하는 다중 모달 통로를 통해 동적으로 엄격하게 조절된다. ABP는 여러 수준(예: 중합재 의 활성화 또는 억제, 필라멘트 분기 유도, 작은 조각으로 필라멘트의 단절, 중합을 촉진하고, 비합화로부터 보호)에서 액틴 역학에 영향을 미칠 수 있으며, 다양한 외세포 신호18,19,20에민감한 엄격한 변조 제어 하에 차례로 발생한다. 여러 수준에서 이러한 규제 검사는 시냅스 세포 골격에서 actin 역학의 엄격한 규제를 지시, 미세 조정 사전 튜닝 사전 및 기초 및 활동 유도 상태에서 신경 생리학의 포스트 냅스 측면.

신경 생리학에서 actin의 중요한 역할을 감안할 때, 여러 연구가 신경 변성, 심리질환뿐만 아니라 신경 발달 질환3,21,23,24,25,26, 27을포함한 광범위한 신경 질환에 연결된 중요한 병원성 이벤트로서 actin 역학의 변경에 대한 증거를 제공한 것은 놀라운 일이 아니다. 그러나, 중요한 격차는 특히 시냅스 세포골격에서 actin 역학의 이해에 남아 있는 신경 생리학 및 병리 생리학에 있는 actin의 중요한 역할을 가리키는 연구 데이터의 부에도 불구하고, 그러나, 중요한 간격은 아직도 actin 역학의 이해에 남아 있습니다. 더 많은 연구 연구는 신경 actin및 병리학 적인 조건 하에서 그것의 변경의 더 나은 이해가 필요 합니다. 이러한 맥락에서 초점의 한 가지 주요 영역은 액틴 중합 상태의 평가입니다. 서양 블로팅 기반 상용 키트가 있습니다 (생체 분석 생화학 키트의 G-Actin / F-Actin; 사이토스켈레톤 SKU BK03728,29)및 F-액틴 레벨6의평가를 위한 홈메이드 아세서. 그러나, 이들은 F-actin와 G-actin의 생화학적 격리를 필요로 하고 그들의 후속 정량화는 면역 blotting 프로토콜에 근거하기 때문에, 그(것)들은 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 본 명세서에서는 F-actin의 기저 수준과 조립 분해의 동적 변화를 평가하는 데 사용할 수 있는 수정으로 이전 연구30에서 조정된 형광 분광계 분석법을 보고합니다. 특히, 우리는 현재 96 웰 플레이트 포맷에 1mL 큐벳에 적합한 샘플을 필요로하는 원래 프로토콜을 효율적으로 수정했습니다. 따라서 수정된 프로토콜은 분석에 필요한 조직/샘플 양을 크게 감소시켰습니다. 또한, 우리는 프로토콜이 뇌 조직 균질화뿐만 아니라 고립 된 시냅스 말단 (시냅토좀 및 시냅토신경좀)과 같은 세포 외 분획에도 적합하다는 증거를 제공합니다. 마지막으로, 분석은 새로 해부 된 설치류 뇌 조직과 장기 저장된 사후 인간 뇌 샘플에 사용할 수 있습니다. 참고, 분석 신경 컨텍스트에서 제시 하는 동안, 그것은 적절 하 게 그들과 관련 된 다른 세포 유형 및 생리 과정에 확장 될 수 있습니다.

Protocol

모든 실험 절차는 오타고 대학의 윤리위원회의 규정에 따라 실험실 동물의 치료 및 사용에 관한 규정에 따라 수행되었습니다 (윤리 프로토콜 번호. AUP95/18 및 AUP80/17) 및 뉴질랜드 의회. 인간의 뇌 조직은 바르셀로나, 스페인에 있는 병원 Clínic-IDIBAPS BioBank의 신경 조직 은행에서 취득되었습니다. 모든 조직 수집 프로토콜은 병원 Clínic의 윤리위원회에 의해 승인되었다, 바르셀로나, 통보 된 동의는 ?…

Representative Results

F-액틴 레벨 평가를 위한 분석의 선형성먼저, 알렉사 플루어(647)의 형광의 선형 증가를 위한 표준 곡선을 확인하였으며 각 실험세트(도 1)에대해 반복되었다. 분석의 선형 범위를 조사하기 위해 설치류(그림 2A 및 2B)와 사후 인간 과목(그림3A 및 3B)으로부터다양한 양의 뇌 균질화가 처리되었다. 상기 …

Discussion

여기에 설명된 분석체는, 본질적으로 수정과 이전 연구30에서 적응, 형광 라벨태그 남백색, 남근을 고용한다. 형광 판로이드 유사체는 고정조직47,48,49에서액틴 필라멘트를 염색하기위한 금 본위제로 간주됩니다. 사실, 그들은 특히 actin 필라멘트50을 식별하는 가장 오래된 도구이며, 여전히 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 뉴질랜드의 신경학회(1835-PG), 뉴질랜드 건강 연구 위원회(#16-597) 및 뉴질랜드 오타고 대학교 해부학부에 의해 지원되었습니다. 우리는 인간의 뇌 조직에 대한 HCB-IDIBAPS 바이오 뱅크 (스페인)의 신경 조직 은행에 빚지고 있습니다. 우리는 비디오의 녹음 및 편집에 그녀의 도움 에 대한 Jiaxian 장 감사합니다.

Materials

3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation
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Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues. J. Vis. Exp. (172), e62268, doi:10.3791/62268 (2021).
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