分子弹簧常量分析由生物元原力探针光谱
Summary
生物元力探针 （BFP） 是一种 原位 动态力光谱 （DFS） 技术。BFP可用于测量活细胞分子相互作用的弹簧常数。此协议对 BFP 检测到的分子键进行弹簧常量分析。
Abstract
生物元原力探针（BFP）最近成为一种原生细胞表面或 原位 动态力光谱（DFS）纳米图，可以测量单分子结合动力学，评估配体受体相互作用的机械特性，可视化蛋白质动态构象变化，更令人振奋地阐明受体介导细胞机械增效机制。最近，BFP被用来测量分子键的弹簧常数。此协议描述了执行分子弹簧恒定 DFS 分析的分步过程。具体来说，讨论了两种 BFP 操作模式，即珠子单元和珠珠模式。此协议侧重于从 DFS 原始数据中提取分子键和细胞的弹簧常数。
Introduction
作为活细胞DFS技术，BFP工程人类红血球（RBC：图1）进入一个超敏感和可调谐的力量传感器与兼容的弹簧恒定范围在0.1-3 pN/nm1，2，3。为了探测配体受体相互作用，BFP 使 DFS 测量在 +1 pN （10-12 N）， +3 nm （10-9米） 和 +0.5 ms （10-3 s） 生效， 空间和时间分辨率4，5.其实验配置由两个对立的微管，即探测器和目标组成。探针微管吸气RBC和珠子粘在其顶点通过生物素-链球菌素的相互作用。珠子上涂有感兴趣的配体（图1A）。目标微管吸气细胞或带有利益受体的珠子，分别对应珠细胞（图1B）和珠珠（图1C）模式。
BFP的建造，组装和DFS实验协议被详细描述之前1，6。简言之，BFP 触摸周期由 5 个阶段组成：方法、因平格、接触、缩回和分离（图 1D）。水平 RBC 顶点位置表示为+xRBC。在开始时，未应力（零力）RBC 变形=xRBC为 0（表 1）。然后，目标由压电翻译驱动，以冲压和缩回从探针珠（图1D）。RBC 探头首先由目标压缩，具有负 RBC 变形+xRBC < 0。在债券事件中，缩回阶段从压缩阶段过渡到拉伸阶段，正 RBC 变形=xRBC > 0 （图 2C和D）。根据胡克定律，BFP 承载力可以测量为F = k RBC ×xRBC，其中kRBC （表1）是 BFP 的 RBC 弹簧常数。当键破裂并完成一个触摸周期后，探针珠返回到零力位置与+xRBC = 0 （图1D）。
为了确定kRBC，我们测量并记录探针微管内孔（Rp）、RBC（R0）和 RBC 和探针珠之间的圆形接触区域（Rc）的半径（图1A）。然后kRBC根据埃文的模型（Eq.1）7，8使用实验室VIEW程序，作为一个虚拟仪器（VI）来操作BFP（图S1A）8，9。
（Eq. 1）
通过建立 BFP 和获得 DFS 原始数据，我们介绍如何分析配体受体对或细胞的弹簧常数。DFS关于糖化蛋白Thy-1和K562细胞轴承集成蛋白相互作用的原始数据α 5 β 1（Thy-1-α 5 β 1： 数字3A和3B）10和纤维蛋白和珠涂层的集成物α IIb β 3（FGN-α IIb β 3： 图3C）11，12已分别用于演示珠细胞和珠珠分析模式。
BFP 实验准备
有关 BFP 实验制备和仪器的详细信息，请参阅先前发布的协议3。简言之，人类RBC在碳/碳酸氢盐缓冲中使用了生物素-PEG3500-NHS进行生物素化。感兴趣的蛋白质与磷酸盐缓冲器中使用MAL-PEG3500-NHS的玻硅酸盐玻璃珠共价耦合。为了附着在生物素化RBC上，探针珠还使用MAL-SA涂上链球菌素（SA）。请参阅材料表和表2。
为了组装BFP（图1，左），第三个称为”帮手”的微管将用于交付探针珠，并粘附到RBC的顶点1，3。SA 涂层探针珠和生物镀金 RBC 之间的共价相互作用比配体受体的利益纽带强得多。因此，分离阶段可以解释为配体受体键破裂，而不是探针珠从RBC分离。
Protocol
Representative Results
Discussion
总之，我们提供了详细的数据分析协议，用于在 BFP 珠子和珠子细胞分析模式下对 DFS 原始数据进行预处理并衍生分子弹簧常数。介绍了确定分子和细胞弹簧常数所需的生物力学模型和方程。尽管研究的集成物不同，但珠珠模式和珠细胞模式测量的kmol具有显著的范围差异（图3A与图3C）。值得注意的是，与珠珠模式，受体是共同连接到玻?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢纪劳姆·特罗亚德茨的有益讨论，王子豪的硬件咨询，悉尼制造中心，格雷格·苏宁和西蒙·林格支持我们的实验室启动。这项工作得到了澳大利亚研究理事会发现项目（DP200101970 – 洛杉矶J.），新南威尔士州心血管能力建设计划（中早期职业研究员格兰特 – 洛杉矶J.），悉尼研究加速器奖（SOAR – 洛杉矶），拉马乔蒂的支持 基金会健康投资赠款（2020HIG76 – 洛杉矶J.）、国家健康和医学研究理事会创意赠款（APP2003904 – L.A.J.）和悉尼大学工程学院启动基金和主要设备计划（L.A.J.）。李宁·阿诺德·朱是澳大利亚研究理事会DECRA研究员（DE190100609）。
Materials
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
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