توصيف تعديل H3K4me3 في النباتات باستخدام الانقسام تحت الأهداف والوسم
Summary
الانقسام تحت الأهداف ووضع العلامات (CUT & Tag) هو استراتيجية تنميط الكروماتين فوق الجينومية الفعالة. يقدم هذا البروتوكول استراتيجية CUT & Tag محسنة لتحديد ملامح تعديلات الهيستون في النباتات.
Abstract
يؤدي التنظيم اللاجينومي على المستوى اللوني ، بما في ذلك تعديلات الحمض النووي والهيستون ، وسلوكيات عوامل النسخ ، والحمض النووي الريبي غير المشفر مع بروتيناتها المعينة ، إلى التحكم الزماني والمكاني في التعبير الجيني. الانقسام تحت الأهداف والوسم (CUT & Tag) هو طريقة ربط الإنزيم التي يتم فيها التعرف على بروتين الكروماتين المحدد أولا بواسطة جسمه المضاد المحدد ، ثم يربط الجسم المضاد بروتين اندماج بروتين A-transposase (pA-Tn5) ، والذي يشق الكروماتين المستهدف في الموقع عن طريق تنشيط أيونات المغنيسيوم. هنا ، نقدم بروتوكول CUT & Tag المنشور سابقا باستخدام نوى سليمة معزولة من أوراق القطن allortetraploid مع التعديل. يمكن استخدام هذا البروتوكول خطوة بخطوة للأبحاث اللاجينومية في النباتات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير تعديلات كبيرة لعزل نوى النبات مع تعليقات نقدية.
Introduction
تخدم مواقع الحمض النووي المرتبطة بعامل النسخ والكروماتين المفتوح المرتبط بعلامات تعديل الهيستون أدوارا وظيفية حاسمة في تنظيم التعبير الجيني وهي المحاور الرئيسية للبحوث اللاجينية1. تقليديا، تم استخدام مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) إلى جانب التسلسل العميق (ChIP-seq) لتحديد على نطاق الجينوم لتعديل هيستون كروماتين معين أو أهداف الحمض النووي مع بروتينات محددة، ويتم اعتماده على نطاق واسع في مجال علم الوراثة اللاجينية2. تم تطوير تقنية الانقسام تحت الأهداف ووضع العلامات (CUT & Tag) في الأصل من قبل مختبر Henikoff لالتقاط شظايا الحمض النووي المرتبطة بالبروتين في جميع أنحاء الجينوم5. عند مقارنتها ب ChIP، يمكن ل CUT & Tagcan إنشاء مكتبات الحمض النووي بدقة عالية وخلفية منخفضة بشكل استثنائي باستخدام عدد صغير من الخلايا مع إجراء مبسط3. حتى الآن ، تم إنشاء طرق لتحليل مناطق الكروماتين مع تعديلات هيستون محددة باستخدام CUT & Tag في الخلايا الحيوانية4,5. على وجه التحديد ، تم أيضا تطوير CUT & Tag أحادي الخلية (scCUT & Tag) بنجاح للأنسجة والخلايا البشرية 6. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد جدار الخلية والأيضات الثانوية ، لا يزال CUT & Tag يمثل تحديا تقنيا للأنسجة النباتية.
في السابق ، أبلغنا عن بروتوكول CUT & Tag باستخدام نوى سليمة معزولة من أوراق القطن allotetraploid 4. لإثبات كفاءة عزل النوى والتقاط الحمض النووي باستخدام الأنسجة النباتية ، يتم عرض إجراء التنميط هنا. وتشمل الخطوات الرئيسية عزل النوى سليمة، والحضانة في الموقع مع الجسم المضاد لتعديل الكروماتين، وحضانة الترانسبوساز، وتكامل المحول، وإعداد مكتبة الحمض النووي. يركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها على إعداد مكتبة CUT & Tag لعزل نوى النبات ومراقبة الجودة.
في هذه الدراسة ، نقدم استراتيجية CUT & Tag المكررة للنباتات. نحن لا نقدم فقط بروتوكولا خطوة بخطوة لتنميط H3K4me3 في أوراق القطن ، ولكننا نقدم أيضا منهجية محسنة لعزل نوى النبات ، بما في ذلك استراتيجية اختيار تركيز المنظفات لتحلل الخلايا المناسب واستراتيجية تصفية النوى. يتم تضمين خطوات مفصلة مع تعليقات انتقادية أيضا في هذا البروتوكول المحدث.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، وصفنا CUT & Tag ، وهي تقنية لتوليد مكتبات الحمض النووي بدقة عالية وخلفية منخفضة بشكل استثنائي باستخدام عدد صغير من الخلايا مع إجراء مبسط مقارنة بالترسيب المناعي للكروماتين (ChIP). نجاحنا مع التنميط H3K4me3 في أوراق القطن يشير إلى أن CUT & Tag ، الذي تم تصميمه لأول مرة للخلايا الحيوانية ، يمكن استخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل ماليا جزئيا من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، 31900395 ، 31971985 ، 31901430) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية ، ومختبر هاينان ياتشو باي للبذور (JBGS ، B21HJ0403) ، ومؤسسة هاينان الإقليمية للعلوم الطبيعية في الصين (320LH002) ، ومشروع JCIC-MCP.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
