Profilazione della modifica H3K4me3 negli impianti utilizzando la scissione sotto target e tagmentazione
Summary
La scissione sotto bersagli e tagmentazione (CUT&Tag) è un’efficiente strategia di profilazione epigenomica della cromatina. Questo protocollo presenta una raffinata strategia CUT&Tag per la profilazione delle modificazioni istoniche negli impianti.
Abstract
La regolazione epigenomica a livello cromatico, comprese le modificazioni del DNA e degli istoni, i comportamenti dei fattori di trascrizione e gli RNA non codificanti con le loro proteine reclutate, portano al controllo temporale e spaziale dell’espressione genica. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) è un metodo di legame enzimatico in cui la proteina cromatina specifica viene prima riconosciuta dal suo anticorpo specifico, e quindi l’anticorpo lega una proteina di fusione A-transposasi (pA-Tn5), che scinde la cromatina mirata in situ dall’attivazione degli ioni magnesio. Qui, forniamo il nostro protocollo CUT&Tag precedentemente pubblicato utilizzando nuclei intatti isolati da foglie di cotone allortetraploid con modifica. Questo protocollo passo-passo può essere utilizzato per la ricerca epigenomica nelle piante. Inoltre, le modifiche sostanziali per l’isolamento dei nuclei vegetali sono fornite con commenti critici.
Introduction
I siti del DNA legante il fattore di trascrizione e la cromatina aperta associata ai segni di modificazione degli istoni svolgono ruoli funzionali critici nella regolazione dell’espressione genica e sono i principali obiettivi della ricerca epigenetica1. Convenzionalmente, il saggio di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) accoppiato con il sequenziamento profondo (ChIP-seq) è stato utilizzato per l’identificazione a livello di genoma di specifici bersagli dell’istone della cromatina o del DNA con proteine specifiche ed è ampiamente adottato nel campo dell’epigenetica2. La tecnologia CUT&Tag (Cleavage under targets and tagmentation) è stata originariamente sviluppata dall’Henikoff Lab per catturare i frammenti di DNA affiliati alle proteine in tutto il genoma5. Rispetto a ChIP, CUT&Tagcan genera librerie di DNA ad alta risoluzione e sfondo eccezionalmente basso utilizzando un piccolo numero di cellule con una procedura semplificata3. Ad oggi, metodi per l’analisi delle regioni della cromatina con specifiche modificazioni istoniche utilizzando CUT&Tag sono stati stabiliti in cellule animali4,5. In particolare, CUT&Tag a singola cellula (scCUT&Tag) è stato sviluppato con successo anche per tessuti e cellule umani6. Tuttavia, a causa della complessità della parete cellulare e dei metaboliti secondari, CUT&Tag è ancora tecnicamente impegnativo per i tessuti vegetali.
In precedenza, abbiamo riportato un protocollo CUT&Tag che utilizza nuclei intatti isolati da foglie di cotone allotetraploidi4. Per dimostrare l’efficienza dell’isolamento dei nuclei e della cattura del DNA utilizzando il tessuto vegetale, la procedura di profilazione è presentata qui. I passaggi principali includono l’isolamento dei nuclei intatti, l’incubazione in situ con l’anticorpo per la modifica della cromatina, l’incubazione della transposasi, l’integrazione dell’adattatore e la preparazione della libreria del DNA. La risoluzione dei problemi si concentra sulla preparazione della libreria CUT&Tag per l’isolamento dei nuclei dell’impianto e il controllo qualità.
In questo studio, presentiamo una raffinata strategia CUT&Tag per le piante. Non solo forniamo un protocollo passo-passo per la profilazione H3K4me3 nelle foglie di cotone, ma forniamo anche una metodologia ottimizzata per l’isolamento dei nuclei vegetali, compresa la strategia per selezionare la concentrazione di detergente per una corretta lisi cellulare e la strategia per filtrare i nuclei. In questo protocollo aggiornato sono inclusi anche passaggi dettagliati con commenti critici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto CUT&Tag, una tecnologia per la generazione di librerie di DNA ad alta risoluzione e background eccezionalmente basso utilizzando un piccolo numero di cellule con una procedura semplificata rispetto all’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Il nostro successo con la profilatura H3K4me3 nelle foglie di cotone suggerisce che CUT&Tag, che è stato inizialmente progettato per le cellule animali, può essere utilizzato anche per le cellule vegetali. Sia il sistema tampone Tris comunemente usato per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente in parte da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) e Fundamental Research Funds for the Central Universities, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) e JCIC-MCP project.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
