標的下およびタグ付け下での切断を用いた植物におけるH3K4me3修飾のプロファイリング
Summary
標的下での切断とタグ付け(CUT&Tag)は、効率的なクロマチンエピゲノムプロファイリング戦略です。このプロトコルは、植物におけるヒストン修飾のプロファイリングのための洗練されたCUT&Tag戦略を提示する。
Abstract
DNAおよびヒストン修飾、転写因子の挙動、およびそれらのリクルートされたタンパク質を有する非コードRNAを含む、有彩色レベルでのエピゲノム調節は、遺伝子発現の時間的および空間的制御をもたらす。標的下での切断およびタグ付け(CUT&Tag)は、特定のクロマチンタンパク質を最初にその特異的抗体によって認識し、次に抗体がプロテインA-トランスポザーゼ(pA-Tn5)融合タンパク質をテテルする酵素テザリング法であり、マグネシウムイオンの活性化によって標的クロマチンを その場で 切断する。ここでは、以前に公開されたCUT&Tagプロトコルを、改変したアロール四倍体コットン葉から単離された無傷の核を用いて提供する。このステップバイステップのプロトコルは、植物におけるエピゲノム研究に使用することができます。さらに、植物核単離のための実質的な改変は、批判的なコメントと共に提供される。
Introduction
ヒストン修飾マークに関連する転写因子結合DNA部位およびオープンクロマチンは、遺伝子発現の調節において重要な機能的役割を果たし、エピジェネティック研究の主要な焦点である1。従来、ディープシーケンシング(ChIP-seq)と組み合わせたクロマチン免疫沈降アッセイ(ChIP)は、特定のタンパク質を有する特定のクロマチンヒストン修飾またはDNA標的のゲノムワイドな同定に用いられており、エピジェネティクスの分野で広く採用されています2。標的下での切断とタグ付け(CUT&Tag)技術は、もともとゲノム全体でタンパク質関連DNA断片を捕捉するためにHenikoff Labによって開発されました5。ChIPと比較すると、CUT&Tagcanは、簡略化された手順で少数の細胞を使用して、高解像度で非常に低いバックグラウンドでDNAライブラリを生成します3。今日まで、CUT&Tagを用いて特定のヒストン修飾を有するクロマチン領域を分析する方法が動物細胞において確立されている4,5。具体的には、単一細胞CUT&Tag(scCUT&Tag)もヒトの組織や細胞向けに開発に成功しています6。しかし、細胞壁と二次代謝産物の複雑さのために、CUT&Tagは植物組織にとって依然として技術的に困難です。
以前、我々は同種四倍体綿葉から単離された無傷の核を用いたCUT&Tagプロトコルを報告した4。植物組織を用いた核単離およびDNA捕捉の効率を実証するために、プロファイリング手順をここに提示する。主なステップには、インタクトな核単離、クロマチン修飾のための抗体との in situ インキュベーション、トランスポザーゼインキュベーション、アダプター統合、およびDNAライブラリー調製が含まれる。トラブルシューティングでは、植物核の分離と品質管理のためのCUT&Tagライブラリの準備に焦点を当てています。
この研究では、植物に対する洗練されたCUT&Tag戦略を提示します。綿葉のH3K4me3プロファイリングのためのステップバイステップのプロトコルを提供するだけでなく、適切な細胞溶解のための洗剤の濃度を選択するための戦略や核をろ過する戦略など、植物核単離のための最適化された方法論も提供します。批判的なコメントを含む詳細な手順も、この更新されたプロトコルに含まれています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、クロマチン免疫沈降法(ChIP)と比較して、少数の細胞を用いて、非常に低いバックグラウンドでDNAライブラリーを高分解能かつ極めて低いバックグラウンドで生成する技術であるCUT&Tagについて説明しました。綿の葉のH3K4me3プロファイリングでの成功は、最初に動物細胞用に設計されたCUT&Tagが植物細胞にも使用できることを示唆しています。ChIPアッセイ8に一般的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC、31900395、31971985、31901430)、中央大学基礎研究費、海南逝州湾種子研究所(JBGS、B21HJ0403)、中国海南省自然科学財団(320LH002)、JCIC-MCPプロジェクトからの助成金によって部分的に財政的に支援されました。
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
