Elaboración de perfiles de modificación de H3K4me3 en plantas utilizando escisión bajo objetivos y etiquetado
Summary
La escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag) es una estrategia eficiente de perfiles epigenómicos de cromatina. Este protocolo presenta una estrategia refinada de CUT&Tag para el perfilado de modificaciones de histonas en plantas.
Abstract
La regulación epigenómica a nivel cromático, incluidas las modificaciones del ADN y las histonas, los comportamientos de los factores de transcripción y los ARN no codificantes con sus proteínas reclutadas, conducen al control temporal y espacial de la expresión génica. La escisión bajo objetivos y tagmentación (CUT&Tag) es un método de anclaje enzimático en el que la proteína de cromatina específica es reconocida primero por su anticuerpo específico, y luego el anticuerpo ata una proteína de fusión de proteína A-transposasa (pA-Tn5), que escinde la cromatina dirigida in situ mediante la activación de iones de magnesio. Aquí, proporcionamos nuestro protocolo CUT&Tag publicado anteriormente utilizando núcleos intactos aislados de hojas de algodón alotretráploides con modificación. Este protocolo paso a paso se puede utilizar para la investigación epigenómica en plantas. Además, se proporcionan modificaciones sustanciales para el aislamiento de los núcleos de plantas con comentarios críticos.
Introduction
Los sitios de ADN de unión al factor de transcripción y la cromatina abierta asociada con las marcas de modificación de histonas desempeñan funciones funcionales críticas en la regulación de la expresión génica y son los principales focos de la investigación epigenética1. Convencionalmente, el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) junto con la secuenciación profunda (ChIP-seq) se ha utilizado para la identificación de todo el genoma de la modificación específica de la histona de cromatina o dianas de ADN con proteínas específicas, y es ampliamente adoptado en el campo de la epigenética2. La tecnología de escisión bajo objetivos y tagmentación (CUT&Tag) fue desarrollada originalmente por el Laboratorio Henikoff para capturar los fragmentos de ADN afiliados a proteínas en todo el genoma5. En comparación con ChIP, CUT&Tagcan genera bibliotecas de ADN a alta resolución y un fondo excepcionalmente bajo utilizando un pequeño número de células con un procedimiento simplificado3. Hasta la fecha, se han establecido métodos para el análisis de regiones de cromatina con modificaciones específicas de histonas utilizando CUT&Tag en células animales4,5. Específicamente, el CUT&Tag unicelular (scCUT&Tag) también se ha desarrollado con éxito para tejidos y células humanas6. Sin embargo, debido a la complejidad de la pared celular y los metabolitos secundarios, CUT&Tag sigue siendo un desafío técnico para los tejidos vegetales.
Anteriormente, reportamos un protocolo CUT&Tag utilizando núcleos intactos aislados de hojas de algodón alotretráploides4. Para demostrar la eficiencia del aislamiento de núcleos y la captura de ADN utilizando tejido vegetal, aquí se presenta el procedimiento de perfil. Los pasos principales incluyen el aislamiento de núcleos intactos, la incubación in situ con el anticuerpo para la modificación de la cromatina, la incubación de la transposasa, la integración del adaptador y la preparación de la biblioteca de ADN. La resolución de problemas se centra en la preparación de la biblioteca CUT&Tag para el aislamiento de núcleos de plantas y el control de calidad.
En este estudio, presentamos una estrategia refinada de CUT&Tag para plantas. No solo proporcionamos un protocolo paso a paso para el perfilado H3K4me3 en hojas de algodón, sino que también proporcionamos una metodología optimizada para el aislamiento de núcleos de plantas, incluida la estrategia para seleccionar la concentración de detergente para la lisis celular adecuada y la estrategia para filtrar los núcleos. Los pasos detallados con comentarios críticos también se incluyen en este protocolo actualizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos descrito CUT&Tag, una tecnología para generar bibliotecas de ADN a alta resolución y un fondo excepcionalmente bajo utilizando un pequeño número de células con un procedimiento simplificado en comparación con la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Nuestro éxito con el perfilado H3K4me3 en hojas de algodón sugiere que CUT&Tag, que fue diseñado por primera vez para células animales, también se puede utilizar para células vegetales. Tanto el sistema tampón Tris comúnmente utilizado para el e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente en parte por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) y Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales, hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) y el proyecto JCIC-MCP.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
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