Profilage de la modification H3K4me3 dans les usines à l’aide du clivage sous cibles et de la marquage
Summary
Le clivage sous les cibles et le marquage (CUT&Tag) est une stratégie efficace de profilage épigénomique de la chromatine. Ce protocole présente une stratégie CUT&Tag affinée pour le profilage des modifications des histones chez les plantes.
Abstract
La régulation épigénomique au niveau chromatique, y compris les modifications de l’ADN et des histones, les comportements des facteurs de transcription et les ARN non codants avec leurs protéines recrutées, conduisent à un contrôle temporel et spatial de l’expression des gènes. Le clivage sous cibles et marquage (CUT&Tag) est une méthode d’attachement enzymatique dans laquelle la protéine spécifique de chromatine est d’abord reconnue par son anticorps spécifique, puis l’anticorps attache une protéine de fusion A-transposase (pA-Tn5), qui clive la chromatine ciblée in situ par l’activation d’ions magnésium. Ici, nous fournissons notre protocole CUT&Tag précédemment publié en utilisant des noyaux intacts isolés à partir de feuilles de coton allortetraploïdes avec modification. Ce protocole étape par étape peut être utilisé pour la recherche épigénomique chez les plantes. En outre, des modifications substantielles pour l’isolement des noyaux végétaux sont accompagnées de commentaires critiques.
Introduction
Les sites d’ADN de liaison au facteur de transcription et la chromatine ouverte associée aux marques de modification des histones jouent un rôle fonctionnel essentiel dans la régulation de l’expression des gènes et constituent les principaux axes de recherche épigénétique1. Classiquement, le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) couplé au séquençage profond (ChIP-seq) a été utilisé pour l’identification à l’échelle du génome de la modification spécifique de l’histone de la chromatine ou de cibles d’ADN avec des protéines spécifiques, et est largement adopté dans le domaine de l’épigénétique2. La technologie de clivage sous cibles et de marquage (CUT&Tag) a été développée à l’origine par le laboratoire Henikoff pour capturer les fragments d’ADN affiliés aux protéines dans tout le génome5. Par rapport au ChIP, CUT&Tag peut générer des bibliothèques d’ADN à haute résolution et avec un arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure simplifiée3. À ce jour, des méthodes d’analyse des régions de chromatine avec des modifications spécifiques des histones à l’aide de CUT&Tag ont été établies dans des cellules animales4,5. Plus précisément, le CUT&Tag unicellulaire (scCUT&Tag) a également été développé avec succès pour les tissus et cellules humains6. Cependant, en raison de la complexité de la paroi cellulaire et des métabolites secondaires, CUT&Tag est toujours techniquement difficile pour les tissus végétaux.
Auparavant, nous avions signalé un protocole CUT&Tag utilisant des noyaux intacts isolés à partir de feuilles de coton allotétraploïdes4. Pour démontrer l’efficacité de l’isolement des noyaux et de la capture de l’ADN à l’aide de tissus végétaux, la procédure de profilage est présentée ici. Les principales étapes comprennent l’isolement des noyaux intacts, l’incubation in situ avec l’anticorps pour la modification de la chromatine, l’incubation de la transposase, l’intégration de l’adaptateur et la préparation de la bibliothèque d’ADN. Le dépannage se concentre sur la préparation de la bibliothèque CUT&Tag pour l’isolation des noyaux de la plante et le contrôle qualité.
Dans cette étude, nous présentons une stratégie CUT&Tag affinée pour les plantes. Non seulement nous fournissons un protocole étape par étape pour le profilage H3K4me3 dans les feuilles de coton, mais nous fournissons également une méthodologie optimisée pour l’isolement des noyaux végétaux, y compris la stratégie de sélection de la concentration de détergent pour une lyse cellulaire appropriée et la stratégie de filtrage des noyaux. Des étapes détaillées avec des commentaires critiques sont également incluses dans ce protocole mis à jour.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit CUT&Tag, une technologie permettant de générer des bibliothèques d’ADN à haute résolution et en arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure simplifiée par rapport à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Notre succès avec le profilage H3K4me3 dans les feuilles de coton suggère que CUT&Tag, qui a d’abord été conçu pour les cellules animales, peut également être utilisé pour les cellules végétales. Le système t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu financièrement en partie par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430), et des fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) et le projet JCIC-MCP.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
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