Summary

Профилирование модификации H3K4me3 в растениях с использованием расщепления под мишенями и меткой

Published: April 22, 2022
doi:

Summary

Расщепление под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) является эффективной стратегией эпигеномного профилирования хроматина. Этот протокол представляет собой усовершенствованную стратегию CUT&Tag для профилирования модификаций гистонов в растениях.

Abstract

Эпигеномная регуляция на хроматическом уровне, включая модификации ДНК и гистонов, поведение факторов транскрипции и некодирующие РНК с их рекрутированными белками, приводят к временному и пространственному контролю экспрессии генов. Расщепление под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) представляет собой метод ферментного связывания, при котором специфический белок хроматина сначала распознается по его специфическому антителу, а затем антитело связывает белок слияния белка А-транспозазы (pA-Tn5), который расщепляет целевой хроматин in situ путем активации ионов магния. Здесь мы предоставляем наш ранее опубликованный протокол CUT&Tag с использованием интактных ядер, выделенных из аллортетраплоидных листьев хлопка с модификацией. Этот пошаговый протокол может быть использован для эпигеномных исследований растений. Кроме того, существенные модификации для выделения ядер растений снабжены критическими комментариями.

Introduction

Участки ДНК, связывающие транскрипционный фактор, и открытый хроматин, связанный со знаками модификации гистона, играют решающую функциональную роль в регулировании экспрессии генов и являются основными направлениями эпигенетических исследований1. Традиционно анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) в сочетании с глубоким секвенированием (ChIP-seq) были использованы для общегеномной идентификации специфических модификаций гистонов хроматина или мишеней ДНК с конкретными белками и широко распространены в области эпигенетики2. Технология расщепления под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) была первоначально разработана лабораторией Хеникова для захвата связанных с белком фрагментов ДНК по всему геному5. По сравнению с ChIP, CUT&Tagcan генерирует библиотеки ДНК с высоким разрешением и исключительно низким фоном, используя небольшое количество клеток с упрощенной процедурой3. На сегодняшний день в клетках животных установлены методы анализа хроматиновых областей со специфическими модификациями гистонов с использованием CUT&Tag4,5. В частности, одноклеточный CUT&Tag (scCUT&Tag) также был успешно разработан для тканей и клеток человека6. Однако из-за сложности клеточной стенки и вторичных метаболитов CUT&Tag по-прежнему технически сложен для растительных тканей.

Ранее мы сообщали о протоколе CUT&Tag с использованием интактных ядер, выделенных из аллотетраплоидных листьев хлопка4. Чтобы продемонстрировать эффективность выделения ядер и захвата ДНК с помощью растительной ткани, процедура профилирования представлена здесь. Основные этапы включают выделение интактных ядер, инкубацию in situ с антителом для модификации хроматина, инкубацию транспозазы, интеграцию адаптеров и подготовку библиотеки ДНК. Поиск и устранение неисправностей сосредоточен на подготовке библиотеки CUT&Tag к выделению ядер растений и контроле качества.

В этом исследовании мы представляем усовершенствованную стратегию CUT&Tag для растений. Мы не только предоставляем пошаговый протокол профилирования H3K4me3 в листьях хлопка, но также предоставляем оптимизированную методологию выделения ядер растений, включая стратегию выбора концентрации моющего средства для правильного лизиса клеток и стратегию фильтрации ядер. Подробные шаги с критическими комментариями также включены в этот обновленный протокол.

Protocol

1. Приготовьте транспозазы и стоковые растворы (День 1) ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части олигонуклеотидные адаптеры комплексуют с транспозазой Tn5 для получения активной транспозазы. Разбавляйте грунтовки (грунтовка А, грунтовка В и грунтовка С) до концентрации 100 мк?…

Representative Results

На рисунке 1 показан рабочий процесс CUT&Tag. На рисунке 2 показано окрашивание DAPI интактных ядер. Целью этапа «изоляции ядер» было получение интактных ядер в достаточном количестве для последующей реакции CUT&Tag. На рисунке 3 показан электрофо…

Discussion

Здесь мы описали CUT&Tag, технологию для генерации библиотек ДНК с высоким разрешением и исключительно низким фоном с использованием небольшого количества клеток с упрощенной процедурой по сравнению с иммунопреципитацией хроматина (ChIP). Наш успех с профилированием H3K4me3 в листьях хлопка п…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) и Фондов фундаментальных исследований для центральных университетов, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Хайнаньского провинциального фонда естественных наук Китая (320LH002) и проекта JCIC-MCP.

Materials

Antibody
Anti-H3K4me3 Millipore 07-473
Normal rabbit IgG Millipore 12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA) Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C
digitonin (~50% (TLC) Sigma-Aldrich D141 Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C
dimethyl sulfoxide (DMSO)
chloroform
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH
ethanol
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) Invitrogen AM9516
magnesium chloride (MgCl2) Make 1 M MgCl2 stock solution
protease inhibitor cocktail Calbiochem 539133-1SET
potassium chloride (KCl) Make 1 M KCl stock solution
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)
sodium chloride (NaCl) Make 5 M NaCl stock solution
spermidine Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C.
sodium dodecyl sulfate (SDS) Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter
Tris base Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution
Triton X-100 Make 20% Triton X-100 stock solution
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag Vazyme S602/S603 Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.
TruePrep Amplify Enzyme Vazyme TD601
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5424R
PCR machine Applied Biosystems ABI9700
Orbital shaker MIULAB HS-25
NanoDrop One  spectrophotometer Thermo Scientific ND-ONE-W

References

  1. Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
  2. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  3. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  4. Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
  5. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  6. Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
  7. Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
  9. Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
  10. Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
  11. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
check_url/62534?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Tao, X., Gao, M., Wang, S., Guan, X. Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation. J. Vis. Exp. (182), e62534, doi:10.3791/62534 (2022).

View Video