Profilierung der H3K4me3-Modifikation in Pflanzen mittels Spaltung unter Targets und Tagmentation
Summary
Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) ist eine effiziente Chromatin-Epigenom-Profiling-Strategie. Dieses Protokoll stellt eine verfeinerte CUT&Tag-Strategie für die Profilierung von Histonmodifikationen in Pflanzen dar.
Abstract
Epigenomische Regulation auf chromatischer Ebene, einschließlich DNA- und Histonmodifikationen, Verhalten von Transkriptionsfaktoren und nicht-kodierende RNAs mit ihren rekrutierten Proteinen, führen zu einer zeitlichen und räumlichen Kontrolle der Genexpression. Spaltung unter Targets und Tagmentation (CUT & Tag) ist eine Enzym-Tethering-Methode, bei der das spezifische Chromatinprotein zuerst durch seinen spezifischen Antikörper erkannt wird und dann der Antikörper ein Protein-A-Transposase-Fusionsprotein (pA-Tn5) anbindet, das das gezielte Chromatin in situ durch die Aktivierung von Magnesiumionen spaltet. Hier stellen wir unser zuvor veröffentlichtes CUT&Tag-Protokoll zur Verfügung, das intakte Kerne verwendet, die aus allortetraploiden Baumwollblättern mit Modifikation isoliert wurden. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll kann für die epigenomische Forschung an Pflanzen verwendet werden. Darüber hinaus werden wesentliche Modifikationen zur Isolierung von Pflanzenkernen mit kritischen Anmerkungen versehen.
Introduction
Transkriptionsfaktor-bindende DNA-Stellen und offenes Chromatin, das mit Histon-Modifikationsmarkierungen assoziiert ist, spielen eine entscheidende funktionelle Rolle bei der Regulierung der Genexpression und sind die Hauptschwerpunkte der epigenetischen Forschung1. Herkömmlicherweise wurde der Chromatin-Immunpräzipitationsassay (ChIP) in Verbindung mit der Tiefensequenzierung (ChIP-seq) für die genomweite Identifizierung spezifischer Chromatin-Histon-Modifikation oder DNA-Ziele mit spezifischen Proteinen verwendet und ist im Bereich der Epigenetik weit verbreitet2. Die CUT&Tag-Technologie (Cleavage under targets and tagmentation) wurde ursprünglich vom Henikoff Lab entwickelt, um die proteinassoziierten DNA-Fragmente im gesamten Genom zu erfassen5. Im Vergleich zu ChIP kann CUT&Tag DNA-Bibliotheken mit hoher Auflösung und außergewöhnlich niedrigem Hintergrund mit einer kleinen Anzahl von Zellen mit einem vereinfachten Verfahren generieren3. Bisher wurden Methoden zur Analyse von Chromatinregionen mit spezifischen Histonmodifikationen mittels CUT&Tag in tierischen Zellen etabliert4,5. Konkret wurde Single-Cell CUT&Tag (scCUT&Tag) auch erfolgreich für menschliche Gewebe und Zellen entwickelt6. Aufgrund der Komplexität der Zellwand und der Sekundärmetaboliten ist CUT&Tag für Pflanzengewebe jedoch immer noch eine technische Herausforderung.
Zuvor berichteten wir über ein CUT&Tag-Protokoll mit intakten Kernen, die aus allotetraploiden Baumwollblättern isoliert wurden4. Um die Effizienz der Nukleisolierung und DNA-Erfassung unter Verwendung von Pflanzengewebe zu demonstrieren, wird hier das Profiling-Verfahren vorgestellt. Zu den wichtigsten Schritten gehören die Isolierung intakter Kerne, die In-situ-Inkubation mit dem Antikörper zur Chromatinmodifikation, die Transposase-Inkubation , die Adapterintegration und die DNA-Bibliotheksvorbereitung . Die Fehlersuche konzentriert sich auf die Vorbereitung der CUT&Tag-Bibliothek für die Isolierung und Qualitätskontrolle der Pflanzenkerne.
In dieser Studie stellen wir eine verfeinerte CUT&Tag-Strategie für Pflanzen vor. Wir bieten nicht nur ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die H3K4me3-Profilierung in Baumwollblättern, sondern auch eine optimierte Methodik für die Isolierung von Pflanzenkernen, einschließlich der Strategie zur Auswahl der Reinigungsmittelkonzentration für die richtige Zelllyse und der Strategie zur Filterung der Kerne. Detaillierte Schritte mit kritischen Kommentaren sind ebenfalls in diesem aktualisierten Protokoll enthalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir CUT & Tag beschrieben, eine Technologie zur Generierung von DNA-Bibliotheken mit hoher Auflösung und außergewöhnlich niedrigem Hintergrund unter Verwendung einer kleinen Anzahl von Zellen mit einem vereinfachten Verfahren im Vergleich zur Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). Unser Erfolg mit der H3K4me3-Profilierung in Baumwollblättern legt nahe, dass CUT&Tag, das ursprünglich für tierische Zellen entwickelt wurde, auch für Pflanzenzellen verwendet werden kann. Sowohl das Tris-Puffersystem, das <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) und Fundamental Research Funds für die Central Universities, das Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), die Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) und das JCIC-MCP-Projekt finanziell unterstützt.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
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