लक्ष्य और टैगमेंटेशन के तहत दरार का उपयोग करके पौधों में H3K4me3 संशोधन की प्रोफाइलिंग
Summary
लक्ष्य और टैगमेंटेशन (CUT&Tag) के तहत दरार एक कुशल क्रोमैटिन epigenomic प्रोफाइलिंग रणनीति है। यह प्रोटोकॉल पौधों में हिस्टोन संशोधनों की प्रोफाइलिंग के लिए एक परिष्कृत कट एंड टैग रणनीति प्रस्तुत करता है।
Abstract
डीएनए और हिस्टोन संशोधनों, प्रतिलेखन कारकों के व्यवहार, और उनके भर्ती प्रोटीन के साथ गैर-कोडिंग आरएनए सहित रंगीन स्तर पर एपिजीनोमिक विनियमन, जीन अभिव्यक्ति के अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण का कारण बनता है। लक्ष्य और टैगमेंटेशन (CUT&Tag) के तहत दरार एक एंजाइम-टेदरिंग विधि है जिसमें विशिष्ट क्रोमैटिन प्रोटीन को पहले इसके विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जाता है, और फिर एंटीबॉडी एक प्रोटीन ए-ट्रांसपोसेज (पीए-टीएन 5) संलयन प्रोटीन को टेथर्स करता है, जो मैग्नीशियम आयनों के सक्रियण द्वारा सीटू में लक्षित क्रोमैटिन को क्लीव करता है। यहां, हम संशोधन के साथ एलोर्टट्राप्लॉइड कपास की पत्तियों से अलग अक्षुण्ण नाभिक का उपयोग करके अपना पहले प्रकाशित कट एंड टैग प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का उपयोग पौधों में एपिजीनोमिक अनुसंधान के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, पौधे नाभिक अलगाव के लिए पर्याप्त संशोधन महत्वपूर्ण टिप्पणियों के साथ प्रदान किए जाते हैं।
Introduction
प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी डीएनए साइटों और हिस्टोन संशोधन चिह्नों से जुड़े खुले क्रोमैटिन जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिका निभाते हैं और एपिजेनेटिक शोध 1 के प्रमुख फोकस हैं। परंपरागत रूप से, क्रोमैटिन immunoprecipitation परख (CHIP) गहरी अनुक्रमण (CHIP-seq) के साथ युग्मित विशिष्ट क्रोमैटिन हिस्टोन संशोधन या विशिष्ट प्रोटीन के साथ डीएनए लक्ष्यों की जीनोम-वाइड पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है, और व्यापक रूप से epigenetics2 के क्षेत्र में अपनाया जाता है। लक्ष्य और टैगमेंटेशन (CUT &Tag) तकनीक के तहत दरार मूल रूप से Henikoff लैब द्वारा विकसित किया गया था ताकि जीनोम 5 में प्रोटीन से जुड़े डीएनए टुकड़ों पर कब्जा किया जा सके। जब CHIP की तुलना में, CUT &Tagcan उच्च रिज़ॉल्यूशन और असाधारण रूप से कम पृष्ठभूमि पर डीएनए पुस्तकालयों को एक सरलीकृत प्रक्रिया के साथ कोशिकाओं की एक छोटी संख्या का उपयोग करके उत्पन्न कर सकता है3। आज तक, CUT &Tag का उपयोग करके विशिष्ट हिस्टोन संशोधनों के साथ क्रोमैटिन क्षेत्रों के विश्लेषण के लिए विधियां पशु कोशिकाओं 4,5 में स्थापित की गई हैं। विशेष रूप से, एकल-सेल CUT &Tag (scCUT &Tag) को मानव ऊतकों और कोशिकाओं के लिए सफलतापूर्वक विकसित किया गया है। हालांकि, सेल की दीवार और माध्यमिक चयापचयों की जटिलता के कारण, CUT & Tag अभी भी पौधे के ऊतकों के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है।
इससे पहले, हमने एलोटेट्राप्लॉइड कपास के पत्तों से अलग अक्षुण्ण नाभिक का उपयोग करके एक CUT &Tag प्रोटोकॉल की सूचना दी थी4। पौधे के ऊतकों का उपयोग करके नाभिक अलगाव और डीएनए कैप्चर की दक्षता का प्रदर्शन करने के लिए, प्रोफाइलिंग प्रक्रिया यहां प्रस्तुत की गई है। प्रमुख चरणों में बरकरार नाभिक अलगाव, सीटू में क्रोमैटिन संशोधन के लिए एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन, ट्रांसपोसेज इनक्यूबेशन, एडेप्टर एकीकरण और डीएनए लाइब्रेरी की तैयारी शामिल है। समस्या निवारण संयंत्र नाभिक अलगाव और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए CUT &Tag लाइब्रेरी तैयारी पर केंद्रित है।
इस अध्ययन में, हम पौधों के लिए एक परिष्कृत कट और टैग रणनीति प्रस्तुत करते हैं। न केवल हम कपास की पत्तियों में H3K4me3 प्रोफाइलिंग के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, बल्कि हम पौधे नाभिक अलगाव के लिए एक अनुकूलित पद्धति भी प्रदान करते हैं, जिसमें उचित सेल लाइसिस के लिए डिटर्जेंट की एकाग्रता का चयन करने की रणनीति और नाभिक को फ़िल्टर करने की रणनीति शामिल है। महत्वपूर्ण टिप्पणियों के साथ विस्तृत चरण भी इस अद्यतन प्रोटोकॉल में शामिल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हमने CUT &Tag का वर्णन किया है, क्रोमैटिन immunoprecipitation (CHIP) की तुलना में एक सरलीकृत प्रक्रिया के साथ कोशिकाओं की एक छोटी संख्या का उपयोग करके उच्च रिज़ॉल्यूशन और असाधारण रूप से कम पृष्ठभूमि पर डीएनए पुस्तकाल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी, 31900395, 31971985, 31901430) और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष, हैनान याझोउ बे सीड लैब (जेबीजीएस, बी 21 एचजे0403), चीन के हैनान प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (320एलएच002), और जेसीआईसी-एमसीपी परियोजना के अनुदान द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
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