Summary
Eksize edilmiş böcek bağırsaklarında hem bitki virüsü proteinlerinin hem de vektör böcek proteinlerinin immünofloresan etiketlenmesi için bu protokol, virüs ve vektör böcekleri, böcek protein fonksiyonları ve virüs bulaşmasının altında yatan moleküler mekanizmalar arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Doğadaki çoğu bitki virüsü, hemipteran böcekler tarafından bir bitkiden diğerine bulaşır. Virüs bulaşmasında oldukça etkili olan vektör böceklerinin yüksek popülasyon yoğunluğu, alanlardaki virüs salgınlarında önemli bir rol oynamaktadır. Virüs-böcek vektör etkileşimlerini incelemek, bitki virüslerini ve vektör böceklerini kontrol etmek için yeni stratejiler tasarlamak amacıyla virüs bulaşması ve salgınlar hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir. İmmünofloresan etiketleme, patojenler ve konakçılar arasındaki etkileşimleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve burada, midgut epitel hücrelerindeki viryonları ve böcek proteinlerini bulmak için güney pirinç siyah çizgili cüce virüsünü (SRBSDV, cins Fijivirus, aile Reoviridae) verimli bir şekilde ileten beyaz sırtlı planthopper'da (WBPH, Sogatella furcifera) kullanılmaktadır. Lazer taramalı konfokal mikroskopi kullanarak, midgut epitel hücrelerinin morfolojik özelliklerini, böcek proteinlerinin hücresel lokalizasyonunu ve viryonların ve bir böcek proteininin kolokalizasyonunu inceledik. Bu protokol, böceklerdeki virüs aktivitelerini, böcek proteinlerinin işlevlerini ve virüs ile vektör böceği arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Tanımlanan bitki virüslerinin çoğu, yaprak bitleri, beyaz sinekler, yaprakçıklar, planthoppers vethrips 1,2'yi içeren Hemiptera düzeninden böcekler tarafından bulaşır. Hemipteryen böceklerin delici-emici ağız kısımları, tükürüğü beslemek ve salgılamak için bitki dokusunu deler, aynı zamanda virüsü verimli bir şekilde iletir2. Bitki virüslerinin vektör böcekleri tarafından farklı bulaşma mekanizmaları tanımlanmıştır. Bunlar arasında kalıcı olmayan, yarı kalıcı ve kalıcı bulunur. Kalıcı tip ya yayılmaz ya da çoğaltıcı 3,4'tür, ancak bu türlerin her ikisi için de bulaşan virüs böceğin vücudu boyunca hareket etmelidir. Kalıcı-yayılım modunda, virüsler başlangıçta böceğin bağırsağının epitel hücrelerinde enfekte olur ve çoğalır, daha sonra farklı dokulara ve sonunda tükürük bezlerine yayılır, buradan daha sonra böcek besleme sırasında tükürük yoluyla bir bitkiye sokulabilirler 5,6. Kalıcı olarak bulaşan virüsler farklı organlardan geçer ve böcek vektörlerinde çoğalırlar, bu da farklı aşamalarda virüs ve vektör bileşenleri arasında spesifik etkileşimler gerektirir 7,8.
Viral proteinler ve böcek proteinleri, vektör böceklerinde virüs tanıma, enfeksiyon, replikasyon veya yayılma için kritik süreçleri kolaylaştırmak için etkileşime girmelidir 9,10. Optik mikroskopi böceklerdeki hücresel yapıları gözlemlemek için kullanılabilse de, virion dağılımını, viral proteinlerin ve böcek proteinlerinin hücresel lokalizasyonunu veya kolokalizasyonunu veya böcek dokularının ve hücrelerinin ultrayapısını gösteremez. İmmünofloresan etiketleme ilk olarak Coons ve ark. tarafından farenin fagositik hücrelerinde spesifik floresein antikorlarının etiketlenmesi yoluyla gerçekleştirilmiştir ve şimdi yaygın olarak kullanılmaktadır11. Floresan antikor tekniği olarak da bilinen immünofloresan tekniği, geliştirilen en eski immünolojik etiketleme tekniklerinden biridir ve antijen ile antikor11,12 arasındaki spesifik bağlanma reaksiyonuna dayanır. Bilinen antikor ilk olarak, hücrelerde veya dokularda karşılık gelen antijenleri tespit etmek için bir prob olarak kullanılan floresein ile etiketlenir13,14. Floresein etiketli antikor, hücrelerdeki veya dokulardaki karşılık gelen antijene bağlandıktan sonra, prob, uyarma dalga boyları ile ışınlandığında ve antijen15'i lokalize etmek için bir floresan mikroskobu ile görüntülendiğinde parlak floresan yayar.
Bitki virüslerinin çoğu vektör böcekleri hemipteranlardır. Bitki virüsü için yüksek bulaşma verimliliğine sahip vektör böceklerinin daha yüksek popülasyon yoğunluğu, virüs salgınlarına yol açabilir5. Pirincin en ciddi patojenlerinden biri olan Güney pirinç siyah çizgili cüce virüsü (SRBSDV, Fijivirus cinsi, Reoviridae familyası), Doğu ve Güneydoğu Asya'da pirinç yetiştirme alanlarına hızla yayılmış ve 2010 yılından bu yana ciddi verim kayıplarına neden olmuştur16,17. Beyaz sırtlı planthopper'ın yetişkinleri ve nimfleri (WBPH, Sogatella furcifera Horváth), SRBSDV'yi pirince yüksek verimlilikle kalıcı-yayılıcı bir şekilde iletir. Saha çalışmaları, SRBSDV kaynaklı pirinç siyah çizgili cüce hastalığının salgınlarının genellikle SRBSDV salgınlarında çok önemli bir faktör olan WBPH'lerin kitlesel uzun mesafeli göçü ile çakıştığını göstermiştir 7,8,18. Vezikülle ilişkili membran proteini 7 (VAMP7), vezikül füzyonu yoluyla maddelerin taşınmasına aracılık edebilen çözünür bir N-etilmaleimide duyarlı faktör bağlanma proteini reseptörüdür (SNARE). VAMP7, SRBSDV'nin in vitro dış majör kapsid proteini ile etkileşime girer, bu da VAMP7'nin virüs iletimi ile yakından ilişkili olabileceğini gösterir16.
Burada sunulan protokolde, midgut epitel hücrelerinde SRBSDV viryonlarını ve VAMP7'yi etiketlemek için örnek olarak virülifer WBPH'den bağırsakları eksize ettik16. Virüsün ilk istila yeri olan midgut epiteli, virüs enfeksiyonu, replikasyonu ve bulaşmasında hayati rol oynar. İlk olarak, bağırsakları nimflerden ve WBPH'lerin yetişkinlerinden çıkarma adımlarını detaylandırdık. İkincisi, bağırsak epitel hücrelerinde SRBSDV viryonlarını ve VAMP7'yi etiketlemek için spesifik floresein etiketli antikorlar kullandık. Daha sonra epitel hücrelerini ve viryonların ve VAMP7'nin hücresel lokalizasyonunu lazer taramalı konfokal mikroskopla gözlemledik. Sonuçlar, SRBSDV viryonlarının ve VAMP7'nin midgut epitel hücrelerinin sitoplazmasında kolokalize olabileceğini gösterdi, bu da VAMP7'nin spesifik işlevinin viryonların midgut epitel hücrelerinden yayılmasıyla ilişkili olabileceğini düşündürdü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Virülifer olmayan böcek yetiştiriciliği
- WBPH'leri pirinç tarlalarından toplayın ve 1 L cam beherlerde pirinç fideleri ile arkadan toplayın, böceklere dayanıklı ağ ile kaplanmış, 28 ° C'de bir inkübatörde 16 saat ışık ve 8 saat karanlık. SRBSDV yumurta yoluyla bulaşmadığından, yeni yumurtadan çıkmış nimfler virülifer değildir.
- Bir fırça kalemiyle, WBPH perileri yumurtadan çıkana kadar her hafta taze pirinç fidelerinin yeni bir kabına beher, böcekleri yetiştiren böceklerden böcekleri nazikçe fırçalayın. Bu yumurtadan çıkmış virülifer olmayan nimfleri 2 veya 3 instar'a yetiştirmeye devam edin.
NOT: WBPH'lerin beherden uçmasını veya zarar görmesini önlemek için dikkatlice fırçalayın.
2. Virüs edinimi ve virülifer böceklerin toplanması
- Bitkilerle beslenerek virülifer olmayan böcekleri cam beherlerden 2 boyutlu virüs edinme erişim süresi (AAP) için böcek geçirmez bir ağ ile kaplanmış taze SRBSDV ile enfekte olmuş pirinç bitkilerine aktarın. Daha sonra, böcekleri taze pirinç fideleri içeren cam beherlerde toplayın.
- 2 d'den sonra, bağırsakların diseksiyonu ve eksizyonu için böcekleri manuel bir aspiratör ile cam beherlerden toplayın.
NOT: SRBSDV'nin minimum AAP'si hem WBPH perileri hem de yetişkinler için 5 dakikadır, ancak böceklerin% 80'e kadar elde etme verimliliği elde etmek için 2 d boyunca taze SRBSDV ile enfekte olmuş pirinç bitkilerinde beslenmelerine izin verilmelidir.
3. Reaktif hazırlama
- 0.01 M fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi hazırlamak için8.5 g NaCl, 3.5 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O ve 0.25 g NaH 2 PO4'ü 1 mL ddH 2O içinde çözün.
- PBS'de %4 (m/v) paraformaldehit hazırlamak için 100 mL PBS'ye 4 g paraformaldehit ekleyin.
- %2 (v/v) Triton X-100 hazırlamak için 98 mL PBS'ye 2 mL Triton X-100 ekleyin.
4. Yetişkinlerin diseksiyonu ve bağırsakların eksizyonu
- Cam slayt üzerine 100 μL PBS yerleştirmek için bir pipetleyici kullanın. Slaytı optik mikroskop sahnesine yerleştirin.
- SRBSDV ile enfekte olmuş yetişkinleri manuel aspiratörlü cam beherlerden toplayın ve 1,5 mL tüplere yerleştirin. Böcekleri felç etmek için tüpleri buzun üzerine yerleştirin ve daha sonra felçli bir yetişkini karın yukarı doğru slayttaki 100 μL PBS'ye aktarın.
NOT: Böcekler buz üzerinde 5 dakika sonra tamamen felç olacaktır. - Vücudu sıkıştırmak için bir elinizde cımbız kullanın ve ardından diğer elinizde başka bir cımbız seti ile kafayı çıkarın.
- Karın kenarlarını bir cımbız seti ile sıkıştırın ve ovipozitörü veya kuyruğun çiftleşme organını diğer setle sıkıştırın. Daha sonra bir karın segmentinin intersegmental zarını dikkatlice çekin ve bağırsakları karın içinde yavaşça açığa çıkarın.
- Zarı yırtmaya devam edin ve yavaş yavaş tüm bağırsağı karnından çıkarın. Tüm bağırsağı çıkarmak için bağırsağın ucuna bağlı kuyruğu yavaşça çekin.
NOT: Çok dikkatli çekin, aksi takdirde bağırsak hasar görür. - Eksize edilmiş bağırsakları 200 μL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin, tüpe 200 μL PBS ekleyin ve bağırsakları iyice yıkamak için çözeltiyi bir pipetle yavaşça emerek serbest bırakın.
5. Perileri diseksiyonu ve bağırsakların eksizyonu
NOT: Perisi cisimleri yetişkin vücutlarından daha kırılgandır ve kuyruktan çekildiğinde bağırsak kolayca zarar görür. Bu nedenle, nimf bağırsağını dışlamak için en güvenilir yöntem kafadan çekmektir.
- Cam slayt üzerine 100 μL PBS yerleştirmek için bir pipetleyici kullanın. Slaytı optik mikroskop sahnesine yerleştirin.
- SRBSDV ile enfekte olmuş nimfleri manuel aspiratörlü cam beherlerden toplayın ve 1,5 mL tüplere yerleştirin. Böcekleri felç etmek için tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, felçli bir perisini, karın yukarı bakacak şekilde slayttaki 100 μL tampona aktarın.
- Perisinin kuyruğunu ayırmak için cımbız kullanın. Daha sonra hafifçe sabitlemek için böcek gövdesini kelepçeleyin ve kafayı sıkıştırmak için diğer seti kullanın. Başın vücuttan ayrılması için bağırsaklara bağlanmasını sürdürürken kafayı yavaşça vücuttan uzaklaştırın, ancak bağırsak hala göğüs kafesine ve karnına bağlanır.
NOT: Kafa ayrıldıktan sonra, nimfin korpus adipozumu dışarı akacak ve PBS'yi bulanık hale getirecektir. Bulanık PBS çözeltisini çıkarın ve 100 μL taze PBS ile değiştirin. - Cımbızlar hala vücudu sıkıştırırken, kafayı dikkatlice hareket ettirmek için diğer seti kullanın ve bağırsağı yavaş yavaş dışarı çekin.
- Bağırsağı kafadan cımbızla yavaşça ayırın ve sonunda planthopper'ın gövdesine zarar vermeden sağlam bir bağırsak elde edin.
- Eksize edilmiş bağırsakları 200 μL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin, tüpe 200 μL PBS ekleyin ve bağırsakları iyice yıkamak için çözeltiyi bir pipetle yavaşça emerek serbest bırakın.
NOT: Eksize edilen bağırsaklar, karın boşluğundan kirletici yağ gövdelerini çıkarmak için PBS ile iyice temizlenmelidir; boyama protokolüne müdahale edebilirler.
6. SRBSDV viryonları ve bir böcek proteini için etiketleme protokolleri
- Bu tahlilde kullanılan antikorları ve montaj ortamını hazırlayın. Antikorlar, SRBSDV viryonları 18'e karşı Dylight 549 (kırmızı) ile etiketlenmiş anti-SRBSDV antikoru, böcek proteini VAMP716,19'a karşı Dylight 488 (yeşil) ile etiketlenmiş anti-VAMP7 antikoru, Dylight 633 falloidin (mavi) ve 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, mavi) içeren montaj ortamıdır.
- Yeni eksize edilmiş ve PBS ile yıkanmış WBPH bağırsaklarını derhal 200 μL'lik bir santrifüj tüpüne 100 μL% 4 (m / v) paraformaldehit içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 2 saat bekletin.
NOT: Yeni eksize edilen WBPH bağırsakları PBS'ye daha uzun süre batırılmamalıdır, aksi takdirde epitel hücreleri hasar görür. - Bir pipetör ile %4 (m/v) paraformaldehiti çıkarın ve ardından 200 μL santrifüj tüpüne 200 μL PBS ekleyin. 10 dakika sonra, herhangi bir paraformaldehiti ortadan kaldırmak için PBS'yi bir pipetleyici kullanarak çıkarın.
- Bu PBS yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
- PBS'yi çıkarın ve 200 μL noniyonik deterjan Triton X-100 (%2, v/v) ekleyin. Noniyonik deterjandaki numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika geçirgenleştirin.
- %2 (v/v) Triton X-100'ü bir pipettörle çıkarın ve kalan deterjanı 200 μL PBS ile üç adet 10 dakikalık yıkama ile yıkayın (bkz. adım 6.3 ve 6.4).
- Dylight 549 (kırmızı) ile etiketlenmiş anti-SRBSDV antikoru ve Dylight 488 (yeşil) 1:50 ile etiketlenmiş anti-VAMP7 antikoru 50 μL boğa serum albümini (%3, m/v) ile seyreltin.
- Seyreltilmiş antikorları tüpe ekleyin ve numuneleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Antikor seyrelticiyi bir pipettörle çıkarın ve ardından kalan antikor seyrelticiyi 200 μL PBS ile üç adet 10 dakikalık yıkama ile yıkayın.
- 1 μL Dylight 633 falloidini 50 μL PBS ile seyreltin.
- Tüpe 50 μL seyreltilmiş faloidin ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin.
- Phalloidin seyrelticiyi bir pipettörle çıkarın ve ardından kalan falloidini 200 μL PBS ile üç 10 dakikalık yıkama ile yıkayın.
NOT: Kapsamlı yıkamalar, arka planı ve spesifik olmayan bağlamayı azaltmak için kritik öneme sahiptir. - Bir mikroskop slaydına DAPI içeren bir damla montaj ortamı yerleştirin ve bağırsakları ortama aktarın.
NOT: Her bağırsağı cımbızla yavaşça açın ve kabarcık oluşturmaktan kaçının. Slayt başına yaklaşık 15 bağırsak vardır. - Kabarcıklar oluşturmadan numunelerin üzerine yavaşça bir kapak camı yerleştirin.
NOT: Lazer taramalı konfokal mikroskopla gözlemden önce floresan söndürmeyi engellemek için slayt karanlıkta 4 °C'de tutulmalıdır. - Tüm örnekleri lazer taramalı konfokal mikroskopla görüntüleyin. Mavi ışığı kullanarak görüntüleri yakalayın ve dosyaları bir bilgisayara kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, bu protokoldeki tüm adımları göstermektedir: böcek yetiştiriciliği, virüs edinimi, bağırsağın eksizyonu, immünofloresan etiketleme ve slaytın yapılması.
Yetişkinlerden eksize edilen WBPH bağırsakları% 4 (m / v) paraformaldehit içinde sabitlendi,% 2 (v / v) Triton X-100 ile geçirgenleştirildi ve% 2 (v / v) Triton X-100 ile permeabilize edildi ve daha sonra Dylight 633 phalloidin10,18 ile inkübe edildi. Şekil 2'deki lazer taramalı konfokal mikrograf, falloidin ile etiketlendikten sonra eksize edilen bağırsağın üç bölümünü gösterir ve bunlar sırasıyla ön bağırsak, midgut ve hindguttur. Bu üç bölüm arasında, midgut SRBSDV'nin ilk enfeksiyon bölgesidir. Bağırsağın tek katmanlı epitel hücre yapısı, böcek proteinlerinin hücresel lokalizasyonunun ve virüs ve böcek proteinlerinin kolokalizasyonunun incelenmesini kolaylaştırır.
Ayrıca WBPH bağırsaklarını eksize ettik ve bunları Dylight 488 (yeşil) etiketli anti-VAMP7 antikoru ve Dylight 549 (kırmızı) etiketli anti-SRBSDV antikoru ile SRBSDV viryonları ile inkübe ettik, sırasıyla17,18,19. Şekil 3, WBPH midgut epitel hücrelerinin sitoplazmasında VAMP7'yi göstermektedir. VAMP7 ve SRBSDV viryonlarının sitoplazmada lazer taramalı konfokal mikroskop ile kolokalize olduğu gösterilmiştir, bu da VAMP7'nin in vivo virüs iletiminde rol oynayabileceğini düşündürmektedir.
Şekil 1: Böcek yetiştirme, bağırsakları çıkarma ve proteini etiketleme adımlarına genel bakış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: WBPH bağırsağının morfolojisi. Dylight 633 falloidin (mavi, etiketleme aktin) floresansı lazer taramalı konfokal mikroskop ile görüntülendi. Ölçek çubuğu, 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: WBPH midgut epitel hücrelerinde SRBSDV viryonlarının ve VAMP7'nin floresan etiketlemesi lazer taramalı konfokal mikroskopla görüntülendi. Bağırsaklar, Dylight 549 (kırmızı) ile etiketlenmiş anti-SRBSDV antikoru ve Dylight 488 (yeşil) ile etiketlenmiş anti-VAMP7 antikoru ile inkübe edildi. Ölçek çubuğu, 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En iyi sonuçlar için, birkaç önemli nokta dikkate alınmalıdır. İlk olarak, toplam popülasyon arasında yüksek oranda virülifer böcek gereklidir. WBPH perileri ve yetişkinler tarafından SRBSDV için minimum AAP 5 dakika17 olmasına rağmen, böceklerin% 80'e varan bir kazanım verimliliği elde etmek için 2 gün boyunca taze SRBSDV ile enfekte olmuş pirinç bitkileriyle beslenmelerine izin verilmelidir. SRBSDV viryonları, midgutların18'inin% 80'inde tespit edilebildiğinden, bu protokolde 2 d AAP'den sonra 2 d'de virülifer böcekleri eksize ettik ve etiketledik. İkincisi, yetişkinlerin ve nimflerin bağırsakları kafadaki tükürük bezlerine ve kuyruktaki ovipozitör veya çiftleşme organına bağlanır. Böylece, bağırsak baştan veya kuyruktan çekilerek dikkatlice eksize edilebilir. Bununla birlikte, teknisyenin böceğin boyutuna göre çekmek için uygun bir yöntem seçmesi gerekir. Yetişkin bağırsak, başı çıkarıldıktan sonra kuyruktan sağlam bir parça halinde çekilebilirken, daha kırılgan perisinin bağırsağı kuyruk20'den çekildiğinde kolayca kırılabilir. Daha güvenilir bir şekilde, nimf bağırsağı, bağırsağı kuyruğundan ayırdıktan sonra kafayı hafifçe çekerek çıkarılabilir. Bu diseksiyon / eksizyon yöntemlerini kullanarak, hızlı bir şekilde sağlam bağırsaklar elde edebilir ve bağırsak epitel hücrelerinin doğal ultrayapısını koruyabiliriz. Ek olarak, diğer organlar ve planthopperlerin dış vücut kabuğu tahrip edilmez, böylece virüs aktivitelerini ve etkileşimlerini keşfetmek için tükürük bezleri ve hemolenf gibi diğer doku ve organların bütünlüğünü korur21.
İmmünofloresan etiketleme yaygın olarak kullanılmasına rağmen, uygun etiketleme protokolleri olmadan güçlü floresan sinyallerin elde edilmesi zor olabilir, bu da deneysel malzemelerin ve zamanın maliyetli israfına neden olur22,23. Etiketlemeden önce, eksize edilen bağırsaklar, kirletici yağ gövdelerini karın boşluğundan dışlamak için PBS ile iyice temizlenmelidir. Kirletici yağ cisimleri, antikorların hücreye girmesini önleyebilir ve lazer taramalı konfokal mikroskopla gözlemlendiğinde görüş alanını belirsiz hale getirebilir. Bu temizlikten sonra, hücre yapısını korumak için bağırsaklar derhal sabitlenmelidir. Antijen taşmasını önlemek için permeabilizasyon tedavi süresinin çok uzun olmadığından emin olun. Ek olarak, geçirgen bağırsaklar, arka planı ve spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için lusiferin konjuge antikorlarla inkübasyondan sonra iyice temizlenmelidir. Kapak camına basılmadan önce, her bir bağırsağı cımbızla yavaşça açın ve kabarcıklardan kaçınmaya çalışın. Slayt hazır olduğunda, lazer taramalı konfokal mikroskop24,25 ile gözlemden önce floresan söndürmeyi engellemek için ışıksız 4 °C'de saklanmalıdır.
Böcek vektörü ile virüs bulaşması, birçok bitki virüsü hastalığının epidemiyolojisinde çok önemli bir adımdır. Bu nedenle bu bulaşmayı bozmak, virüs hastalıklarına karşı etkili bir stratejidir7,8, bu nedenle bu virüslerin bulaşma mekanizmasını aydınlatmak büyük teorik ve pratik öneme sahiptir. İmmünofloresan, bu nedenle, sürekli olarak bulaşan bitki virüslerini lokalize etmek ve proteinlerinin işlevini in vivo olarak virüs iletimindeki çeşitli adımları anlamaya yönelik olarak incelemek için çok yararlıdır. Son yıllarda, immünofloresan ve lazer taramalı konfokal mikroskopi, bitki virüslerinin iletimi sırasında vektör hücrelerinde ve dokularında virüs etkileşimlerini anlamada atılımlardan sorumlu kritik araçlar olmuştur. Mevcut protokolü kullanarak, SRBSDV viryonlarını ve VAMP7'yi yetişkinlerin ve nimflerin midgutlarının epitel hücrelerinde lokalize edebildik ve herhangi bir kolokalizasyonu belirleyebildik. Phalloidin, midgut epitel hücre zarının ana hatlarını görüntülemek için aktini etiketlemek için kullanıldı ve DAPI, çekirdeği etiketlemek için kullanıldı. WBPH bağırsak ve midgut epitel hücrelerinin yapıları, lazer taramalı konfokal mikroskopi ile bakıldığında farklıdır. Bu protokol, böceklerin sindirim sistemi anatomisini görüntülemek, viryonları, diğer patojenleri ve böcek proteinlerini lokalize etmek ve böceklerdeki patojen aktivitelerini, böcek protein fonksiyonlarını ve patojenler ile böcek proteinleri arasındaki etkileşimleri incelemek için güvenilir bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (31630058 X.W.'ye ve 31772134 W.L.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G.
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D. Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. Nault, L. R., Rodriquez, J. G. , Wiley. New York. 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y.
- Kruse, A., et al. Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
