Een permanent venster voor het onderzoeken van kankermetastase naar de longen

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de chirurgische implantatie van een permanent inwonend optisch venster voor de muriene thorax, dat een hoge resolutie, intravitale beeldvorming van de long mogelijk maakt. De duurzaamheid van het venster maakt het zeer geschikt voor de studie van dynamische cellulaire processen in de longen, vooral die welke langzaam evolueren, zoals gemetastaseerde progressie van verspreide tumorcellen.

Abstract

Metastase, goed voor ~ 90% van de kankergerelateerde mortaliteit, omvat de systemische verspreiding van kankercellen van primaire tumoren naar secundaire plaatsen zoals het bot, de hersenen en de longen. Hoewel uitgebreid bestudeerd, blijven de mechanistische details van dit proces slecht begrepen. Hoewel gemeenschappelijke beeldvormingsmodaliteiten, waaronder computertomografie (CT), positronemissietomografie (PET) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), verschillende gradaties van grove visualisatie bieden, mist elk de temporele en ruimtelijke resolutie die nodig is om de dynamiek van individuele tumorcellen te detecteren. Om dit aan te pakken, zijn tal van technieken beschreven voor intravitale beeldvorming van gemeenschappelijke metastatische sites. Van deze plaatsen is de long bijzonder moeilijk gebleken om toegang te krijgen voor intravitale beeldvorming vanwege de delicatesse en kritieke rol bij het in stand houden van het leven. Hoewel verschillende benaderingen eerder zijn beschreven voor eencellige intravitale beeldvorming van de intacte long, omvatten ze allemaal zeer invasieve en terminale procedures, waarbij de maximaal mogelijke beeldvormingsduur wordt beperkt tot 6-12 uur. Hier wordt een verbeterde techniek beschreven voor de permanente implantatie van een minimaal invasief thoracale optische venster voor hoge-resolutie beeldvorming van de long (WHRIL). In combinatie met een aangepaste benadering van microcartografie, vergemakkelijkt het innovatieve optische venster seriële intravitale beeldvorming van de intacte long met eencellige resolutie gedurende meerdere beeldvormingssessies en verspreid over meerdere weken. Gezien de ongekende tijdsduur waarover beeldvormingsgegevens kunnen worden verzameld, kan de WHRIL de versnelde ontdekking van de dynamische mechanismen die ten grondslag liggen aan metastatische progressie en tal van aanvullende biologische processen in de longen vergemakkelijken.

Introduction

Verantwoordelijk voor ~ 90% van de sterfgevallen, metastas is de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte¹. Onder de belangrijkste plaatsen van klinisch waargenomen metastase (bot, lever, long, hersenen)², is de long bijzonder uitdagend gebleken voor in vivo beeldvorming via intravitale microscopie. Dit komt omdat de long een delicaat orgaan is in perpetuum mobile. De continue beweging van de longen, verder verergerd door intrathoracale cardiale beweging, vormt een aanzienlijke barrière voor nauwkeurige beeldvorming. Daarom, vanwege de relatieve ontoegankelijkheid tot modaliteiten voor hoge resolutie intravitale optische beeldvorming, is kankergroei in de longen vaak beschouwd als een occult proces³.

In de klinische setting maken beeldvormingstechnologieën zoals computertomografie (CT), positronemissietomografie (PET) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) visualisatie diep in intacte vitale organen zoals de long^{mogelijk 4}. Hoewel deze modaliteiten zorgen voor een uitstekend beeld van het grove orgaan (vaak zelfs onthullende pathologie voorafgaand aan het begin van klinische symptomen), zijn ze van onvoldoende resolutie om individuele gedissemineerde tumorcellen te detecteren terwijl ze zich door de vroege stadia van metastase ontwikkelen. Bijgevolg, tegen de tijd dat de bovengenoemde modaliteiten enige indicatie van metastase naar de long geven, zijn gemetastaseerde foci al goed ingeburgerd en prolifererend. Aangezien de tumormicro-omgeving een cruciale rol speelt bij de progressie van kanker en metastasevorming^5,6, is er grote interesse in het onderzoeken van de vroegste stappen van gemetastaseerd zaaien in vivo. Deze interesse wordt verder gevoed door de toegenomen waardering dat kankercellen zich verspreiden nog voordat de primaire tumor wordt gedetecteerd^7,8 en het toenemende bewijs dat ze overleven als afzonderlijke cellen en in een slapende toestand gedurende jaren tot decennia voordat ze uitgroeien in macro-metastase⁹.

Voorheen was beeldvorming van de long met eencellige resolutie noodzakelijkerwijs ex vivo of explantische preparaten^10,11,12,13,waarbij analyses werden beperkt tot enkele tijdspunten. Hoewel deze preparaten nuttige informatie bieden, geven ze geen inzicht in de dynamiek van tumorcellen in het orgaan dat is verbonden met een intacte bloedsomloop.

Recente technologische ontwikkelingen in beeldvorming hebben intravitale visualisatie van de intacte long met eencellige resolutie mogelijk gemaakt gedurende perioden van maximaal 12 h^14,15,16. Dit werd bereikt in een muizenmodel met behulp van een protocol dat mechanische ventilatie, resectie van de ribbenkast en vacuümondersteunde longimmobilisatie omvatte. Ondanks het aanbieden van de eerste beelden met een enkele celresolutie van de fysiologisch intacte long, is de techniek echter zeer invasief en terminaal, waardoor verdere beeldvormingssessies buiten de indexprocedure worden uitgesloten. Deze beperking voorkomt daarom de toepassing ervan op de studie van gemetastaseerde stappen die langer dan 12 uur duren, zoals rust en het opnieuw initiëren van groei^14,15,16. Verder moeten patronen van cellulair gedrag waargenomen met behulp van deze beeldvormingsbenadering voorzichtig worden geïnterpreteerd, aangezien vacuümgeïnduceerde drukverschillen waarschijnlijk afleidingen in de bloedstroom veroorzaken.

Om deze beperkingen te overwinnen, is onlangs een minimaal invasief venster voor beeldvorming van de long met hoge resolutie (WHRIL) ontwikkeld, dat seriële beeldvorming over een langere periode van dagen tot weken mogelijk maakt, zonder de noodzaak van mechanische beademing¹⁷. De techniek omvat het creëren van een ‘transparante ribbenkast’ met een afgesloten thoracale holte voor het behoud van een normale longfunctie. De procedure wordt goed verdragen, waardoor de muis kan herstellen zonder zinvolle wijziging van de basislijnactiviteit en -functie. Om precies hetzelfde longgebied bij elke respectieve beeldvormingssessie betrouwbaar te lokaliseren, werd een techniek die bekend staat als microcartografie toegepast op dit venster¹⁸. Door dit venster was het mogelijk om beelden van cellen vast te leggen terwijl ze bij het vaatbed van de long aankomen, het endotheel kruisen, celdeling ondergaan en uitgroeien tot micrometastasen.

Hier presenteert de studie een gedetailleerde beschrijving van een verbeterd chirurgisch protocol voor implantatie van de WHRIL, dat de operatie vereenvoudigt en tegelijkertijd de reproduceerbaarheid en kwaliteit ervan verhoogt. Hoewel dit protocol is ontworpen om onderzoek mogelijk te maken naar de dynamische processen die ten grondslag liggen aan metastase, kan de techniek als alternatief worden toegepast op onderzoeken van tal van processen van longbiologie en pathologie.

Protocol

Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, inclusief voorafgaande goedkeuring door het Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Passivering van ramen Spoel de optische kozijnen(aanvullende figuur 2)af met een 1% (w/v) oplossing van enzymatisch actief reinigingsmiddel. Dompel in een glazen pot de o…

Representative Results

De stappen van de chirurgische ingreep die in dit protocol worden beschreven, zijn samengevat en geïllustreerd in figuur 1. Kortom, voorafgaand aan de operatie worden muizen verdoofd en wordt het haar over de linker thorax verwijderd. Muizen worden geïntubeerd en mechanisch geventileerd om te overleven bij het doorbreken van de thoracale holte. Zacht weefsel boven de ribben wordt weggesneden en er ontstaat een klein cirkelvormig defect, dat de6e en7e ribben overspant…

Discussion

Op plaatsen van verre metastase, zoals de long, geeft optische beeldvorming met hoge resolutie inzicht in de uitgebreide dynamiek van tumorcelmetastase. Door in vivo visualisatie van afzonderlijke kankercellen en hun interacties met het gastheerweefsel mogelijk te maken, is intravitale beeldvorming met hoge resolutie instrumenteel gebleken voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan metastase.

Hier wordt een verbeterd chirurgisch protocol beschreven voor de perm…

Materials

1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	N/A	concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres	Invitrogen	F8827
5 mm coverslip	Electron Microscopy Sciences	72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
5% Isoflurane	Henry Schein, Inc	29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle	Ethicon, Inc.	774B
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275
8 mm stainless steel window frame	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie	Ethicon, Inc.	LA55G
5 mm disposable biopsy punch	Integra	33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors	Roboz	RS-5980
Buprenorphine	Hospira	0409-2012-32
Cautery pen	Braintree Scientific	GEM 5917
Chlorhexidine gluconate	Becton, Dickinson and Company	260100	ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive	Henkel Adhesives	LOC1363589
Fiber-optic illuminator	O.C. White Company	FL3000
Bead sterilizer	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Germinator 500
Graefe forceps	Roboz	RS-5135
Infrared heat lamp	Braintree Scientific	HL-1
Insulin syringes	Becton Dickinson	329424
Isoflurane vaporizer	SurgiVet	VCT302
Jacobson needle holder with lock	Kalson Surgical	T1-140
Long cotton tip applicators	Medline Industries	MDS202055
Nair	Church & Dwight Co., Inc.	40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin	Johnson & Johnson	501373005	Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
Paper tape	Fisher Scientific	S68702
Murine ventilator	Kent Scientific	PS-02	PhysioSuite
Rectangular Cover Glass	Corning	2980-225
Rodent intubation stand	Braintree Scientific	RIS 100
Small animal lung inflation bulb	Harvard Apparatus	72-9083
Stainless steel cutting tool	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic	Hi-Tech Pharmacal Co.	50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming	Kent Scientific	SURGI-M02	Heated surgical platform
Tracheal catheter	Exelint International	26746	22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe	Ted Pella, Inc.	528-112