חלון קבוע לחקירת גרורות סרטן לריאה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת חלון אופטי השוכנות לצמיתות עבור בית החזה מורין, המאפשר הדמיה תוך-ויאלית ברזולוציה גבוהה של הריאה. קביעות החלון הופכת אותו מתאים היטב לחקר תהליכים תאיים דינמיים בריאה, במיוחד אלה המתפתחים לאט, כגון התקדמות גרורתית של תאים סרטניים מופצים.
Abstract
גרורות, המהוות כ-90% מהתמותה הקשורה לסרטן, כוללת התפשטות מערכתית של תאים סרטניים מגידולים ראשוניים לאתרים משניים כגון העצם, המוח והריאה. למרות שנחקר בהרחבה, הפרטים המכניסטיים של תהליך זה נשארים מובנים היטב. בעוד שמודליות הדמיה נפוצות, כולל טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) והדמיה תהודה מגנטית (MRI), מציעות דרגות שונות של הדמיה גסה, כל אחת מהן חסרה את הרזולוציה הזמנית והמרחבית הדרושה כדי לזהות את הדינמיקה של תאי גידול בודדים. כדי לטפל בכך, טכניקות רבות תוארו עבור הדמיה תוך-וינטלית של אתרים גרורתיים נפוצים. מתוך אתרים אלה, הריאה הוכיחה מאתגרת במיוחד לגישה להדמיה תוך-ויאלית בשל עדינותה ותפקידה הקריטי בשמירה על החיים. למרות מספר גישות תוארו בעבר עבור הדמיה תוך-וינטלית של תא יחיד של הריאה שלם, כל כרוך מאוד פולשני הליכים סופני, הגבלת משך ההדמיה המרבי האפשרי ל 6-12 שעות. מתואר כאן טכניקה משופרת להשתלה קבועה של חלון אופטי בית החזה זעיר פולשני להדמיה ברזולוציה גבוהה של הריאה (WHRIL). בשילוב עם גישה מותאמת למיקרוקרטוגרפיה, החלון האופטי החדשני מאפשר הדמיה תוך-וינטלית סדרתית של הריאה השלמה ברזולוציה של תא בודד על פני מפגשי הדמיה מרובים ומשתרע על פני מספר שבועות. בהתחשב במשך הזמן חסר התקדים שבו ניתן לאסוף נתוני הדמיה, WHRIL יכול להקל על גילוי מואץ של המנגנונים הדינמיים שבבסיס ההתקדמות גרורתית ותהליכים ביולוגיים רבים נוספים בתוך הריאה.
Introduction
אחראי ~ 90% ממקרי המוות, גרורות הוא הגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן1. בין האתרים העיקריים של גרורות שנצפו קלינית (עצם, כבד, ריאות, מוח)2, הריאה הוכיחה מאתגרת במיוחד עבור הדמיה in vivo באמצעות מיקרוסקופיה תוך ויאלית. הסיבה לכך היא שהריאה היא איבר עדין בתנועה מתמדת. התנועה המתמשכת של הריאות, המורכבת עוד יותר על ידי תנועת לב תוך-גזעית, מהווה מחסום משמעותי להדמיה מדויקת. לכן, בשל חוסר נגישותה היחסית לאופנה להדמיה אופטית תוך-וינטלית ברזולוציה גבוהה, צמיחת הסרטן בתוך הריאה נחשבה לעתים קרובות לתהליך נסתר3.
בסביבה הקלינית, טכנולוגיות הדמיה כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) והדמיה תהודה מגנטית (MRI) מאפשרות הדמיה עמוק בתוך איברים חיוניים שלמים כגון הריאה4. עם זאת, בעוד שיטות אלה מספקות תצוגות מצוינות של האיבר ברוטו (לעתים קרובות אפילו חושף פתולוגיה לפני הופעת הסימפטומים הקליניים), הם ברזולוציה לקויה כדי לזהות תאים סרטניים מופצים בודדים כפי שהם מתקדמים דרך השלבים המוקדמים של גרורות. כתוצאה מכך, עד שהמודל הנ”ל מספק כל אינדיקציה לגרורות לריאה, מוקדים גרורתיים כבר מבוססים ומתרבים היטב. מאז microenvironment הגידול ממלא תפקיד מרכזי בהתקדמות הסרטן היווצרות גרורות5,6, יש עניין רב לחקור את השלבים המוקדמים ביותר של זריעה גרורתית ב vivo. עניין זה מתודלק עוד יותר על ידי ההערכה המוגברת שתאים סרטניים מופצים עוד לפני שהגידול העיקרי מזוהה7,8 והראיות הגוברות לכך שהם שורדים כתאים בודדים ובמצב רדום במשך שנים עד עשרות שנים לפני שנשרים לתוך מאקרו-גרורות9.
בעבר, הדמיה של הריאה ברזולוציה של תא אחד כללה בהכרח תכשירים ex vivo או explant10,11,12,13, הגבלת ניתוחים לנקודות זמן בודדות. בעוד שתכשירים אלה מספקים מידע שימושי, הם אינם מספקים כל תובנה על הדינמיקה של תאים סרטניים בתוך האיבר המחובר למערכת מחזור שלמה.
ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה בהדמיה אפשרה הדמיה תוך-וינטלית של הריאה השלמה ברזולוציה של תא בודד על פני תקופות של עד 12 שעות14,15,16. זה נעשה במודל מורין באמצעות פרוטוקול שכלל אוורור מכני, כריתה של בית החזה, ושתקת ריאות בסיוע ואקום. עם זאת, למרות המציע את התמונות הראשונות ברזולוציה של תא בודד של הריאה השלם מבחינה פיזיולוגית, הטכניקה היא פולשנית מאוד סופני, ובכך מונע מפגשי הדמיה נוספים מעבר להליך האינדקס. מגבלה זו, אם כן, מונעת את יישומה לחקר צעדים גרורתיים הנגזרים מ- 12 שעות, כגון רדומים וייזום מחדש של צמיחה14,15,16. יתר על כן, דפוסים של התנהגות תאית שנצפו באמצעות גישה הדמיה זו חייבים להתפרש בזהירות, בהתחשב בכך הפרשי לחץ הנגרמים על ידי ואקום עלולים לגרום הסחות בזרימת הדם.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותח לאחרונה חלון זעיר פולשני להדמיה ברזולוציה גבוהה של הריאה (WHRIL), המקלה על הדמיה סדרתית על פני תקופה ממושכת של ימים עד שבועות, ללא צורך באוורור מכני17. הטכניקה כרוכה ביצירת ‘בית החזה שקוף’ עם חלל בית החזה אטום לשימור תפקוד תקין של הריאות. ההליך נסבל היטב, ומאפשר לעכבר להתאושש ללא שינוי משמעותי בפעילות הבסיסית ובתפקוד. כדי אמין לוקליזציה בדיוק באותו אזור ריאות בכל מפגש הדמיה בהתאמה, טכניקה המכונה microcartography הוחל על חלון זה18. דרך חלון זה, ניתן היה ללכוד תמונות של תאים כשהם מגיעים למיטת כלי הדם של הריאה, חוצים את האנדהותל, עוברים חלוקת תאים וגדלים למיקרו גרורות.
כאן, המחקר מציג תיאור מפורט של פרוטוקול כירורגי משופר להשתלה של WHRIL, אשר מפשט את הניתוח ובו זמנית להגדיל את יכולת הרבייה והאיכות שלה. בעוד פרוטוקול זה נועד לאפשר חקירה של התהליכים הדינמיים שבבסיס גרורות, הטכניקה עשויה להיות מיושמת לחילופין על חקירות של תהליכים רבים של ביולוגיה ריאות ופתולוגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
באתרים של גרורות רחוקות כגון הריאה, הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה מספקת תובנה על הדינמיקה המשוכללת של גרורות תאים סרטניים. על ידי הפעלת הדמיה של תאים סרטניים בודדים והאינטראקציות שלהם עם הרקמה המארחת, הדמיה תוך-וינטלית ברזולוציה גבוהה הוכיחה את עצמה כמכשיר להבנת המנגנונים הבסיסיים ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: CA216248, CA013330, רות ל. קירששטיין T32 של מונטיפיורי הכשרה Grant CA200561, פרס METAvivor תחילת הקריירה, המרכז לביופוטונייקה Gruss-Lipper ותוכנית ההדמיה המשולבת שלה, וג’יין א’ ומיילס פ. דמפסי. ברצוננו להודות למתקן ההדמיה האנליטית (AIF) במכללת איינשטיין לרפואה על תמיכת ההדמיה.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D. Classification of lung cancer. Seminars in Roentgenology. 46 (3), 178-186 (2011).
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E. Endobronchial metastasis. Archives of Internal Medicine. 135 (4), 543-547 (1975).
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D. Lung metastases. European Radiology. 6 (5), 596-606 (1996).
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P. ImageJ plugin HyperStackReg V5.6. Zenodo. , (2018).
