Uma janela permanente para investigar metástase do câncer no pulmão
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação cirúrgica de uma janela óptica permanentemente habitante para o tórax murino, que permite imagens intravitais de alta resolução do pulmão. A permanência da janela torna-a adequada ao estudo de processos celulares dinâmicos no pulmão, especialmente aqueles que estão evoluindo lentamente, como a progressão metastática das células tumorais disseminadas.
Abstract
A metástase, responsável por ~90% da mortalidade relacionada ao câncer, envolve a disseminação sistêmica de células cancerígenas de tumores primários para locais secundários, como osso, cérebro e pulmão. Embora amplamente estudados, os detalhes mecanicistas desse processo permanecem mal compreendidos. Enquanto as modalidades de imagem comum, incluindo tomografia computadorizada (TC), tomografia por emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética (RM), oferecem diferentes graus de visualização bruta, cada uma carece da resolução temporal e espacial necessária para detectar a dinâmica das células tumorais individuais. Para lidar com isso, inúmeras técnicas foram descritas para imagens intravitais de locais metastáticos comuns. Desses locais, o pulmão tem se mostrado especialmente desafiador para o acesso a imagens intravitais devido à sua delicadeza e papel crítico na manutenção da vida. Embora várias abordagens tenham sido descritas anteriormente para imagens intravitais unicelulares do pulmão intacto, todas envolvem procedimentos altamente invasivos e terminais, limitando a duração máxima possível de imagem a 6-12 h. Descrita aqui é uma técnica aprimorada para a implantação permanente de uma janela óptica torácica minimamente invasiva para imagem de alta resolução do pulmão (WHRIL). Combinada com uma abordagem adaptada à microcartografia, a inovadora janela óptica facilita a imagem intravital serial do pulmão intacto em resolução unicelular em várias sessões de imagem e abrangendo várias semanas. Dada a duração sem precedentes do tempo sobre o qual os dados de imagem podem ser coletados, o WHRIL pode facilitar a descoberta acelerada dos mecanismos dinâmicos subjacentes à progressão metastática e numerosos processos biológicos adicionais dentro do pulmão.
Introduction
Responsável por ~90% das mortes, a metástase é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer1. Entre os principais locais de metástase clinicamente observada (osso, fígado, pulmão, cérebro)2, o pulmão tem se mostrado particularmente desafiador para a imagem in vivo via microscopia intravital. Isso porque o pulmão é um órgão delicado em movimento perpétuo. O movimento contínuo dos pulmões, ainda mais agravado pelo movimento cardíaco intratorácico, representa uma barreira substancial para a imagem precisa. Portanto, devido à sua relativa inacessibilidade às modalidades de imagem óptica intravital de alta resolução, o crescimento do câncer no pulmão tem sido muitas vezes considerado um processo oculto3.
No cenário clínico, tecnologias de imagem como tomografia computadorizada (TC), tomografia por emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética (RM) permitem a visualização profunda em órgãos vitais intactos, como o pulmão4. No entanto, embora essas modalidades proporcionem excelentes visões do órgão bruto (muitas vezes até mesmo revelando patologia antes do início dos sintomas clínicos), elas são de resolução inadequada para detectar células tumorais disseminadas individualmente à medida que avançam através dos estágios iniciais da metástase. Consequentemente, quando as modalidades supracitadas fornecem qualquer indicação de metástase para o pulmão, os focos metastáticos já estão bem estabelecidos e proliferando. Uma vez que o microambiente tumoral desempenha um papel fundamental na progressão do câncer e na formação de metástase5,6, há grande interesse em investigar os primeiros passos da semeadura metastática in vivo. Esse interesse é ainda mais alimentado pelo aumento da valorização que as células cancerígenas disseminam antes mesmo do tumor primário ser detectado7,8 e as evidências crescentes de que elas sobrevivem como células únicas e em um estado adormecido por anos a décadas antes de crescer em macro-metástase9.
Anteriormente, a imagem do pulmão em resolução unicelular envolveu necessariamente preparações ex vivo ou explant10,11,12,13, limitando análises a pontos de tempo único. Embora essas preparações forneçam informações úteis, elas não fornecem qualquer visão sobre a dinâmica das células tumorais dentro do órgão conectadas a um sistema circulatório intacto.
Os recentes avanços tecnológicos na imagem permitiram a visualização intravital do pulmão intacto em resolução unicelular durante períodos de até 12 h14,15,16. Isso foi realizado em um modelo murino utilizando um protocolo que envolvia ventilação mecânica, ressecção da caixa torácica e imobilização pulmonar assistida a vácuo. No entanto, apesar de oferecer as primeiras imagens de resolução celular única do pulmão fisiologicamente intacto, a técnica é altamente invasiva e terminal, impedindo assim mais sessões de imagem além do procedimento de índice. Essa limitação, portanto, impede sua aplicação ao estudo de passos metastáticos que levam mais de 12h, como dormência e reinsício do crescimento14,15,16. Além disso, os padrões de comportamento celular observados usando essa abordagem de imagem devem ser interpretados com cautela, uma vez que os diferenciais de pressão induzidos pelo vácuo provavelmente causarão desvios no fluxo sanguíneo.
Para superar essas limitações, foi desenvolvida recentemente uma Janela minimamente invasiva para Imagem de Alta Resolução do Pulmão (WHRIL), facilitando a imagem serial durante um longo período de dias a semanas, sem a necessidade de ventilação mecânica17. A técnica envolve a criação de uma “caixa torácica transparente” com cavidade torácica selada para a preservação da função pulmonar normal. O procedimento é bem tolerado, permitindo que o mouse se recupere sem alteração significativa na atividade e função da linha de base. Para localização confiável exatamente da mesma região pulmonar em cada sessão de imagem respectiva, uma técnica conhecida como microcartografia foi aplicada nesta janela18. Através desta janela, foi possível capturar imagens de células quando elas chegam ao leito vascular do pulmão, cruzam o endotélio, passam por divisão celular e crescem em micrometástas.
Aqui, o estudo apresenta uma descrição detalhada de um protocolo cirúrgico aprimorado para implantação do WHRIL, que simplifica a cirurgia ao mesmo tempo em que aumenta sua reprodutibilidade e qualidade. Embora este protocolo tenha sido projetado para permitir a investigação dos processos dinâmicos subjacentes à metástase, a técnica pode ser aplicada alternativamente a investigações de inúmeros processos de biologia pulmonar e patologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em locais de metástase distante, como o pulmão, imagens ópticas de alta resolução fornecem uma visão da dinâmica elaborada da metástase celular tumoral. Ao permitir a visualização in vivo de células cancerígenas únicas e suas interações com o tecido hospedeiro, a imagem intravital de alta resolução tem se mostrado fundamental para entender os mecanismos subjacentes à metástase.
Descrito aqui é um protocolo cirúrgico melhorado para a implantação torácica permane…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561, METAvivor Early Career Award, Gruss-Lipper Biophotonics Center e seu Programa Integrado de Imagem, e Jane A. e Myles P. Dempsey. Gostaríamos de agradecer ao Centro de Imagem Analítica (AIF) da Faculdade de Medicina einstein pelo apoio à imagem.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
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