Постоянное окно для исследования метастазирования рака в легкие

Summary

Здесь мы представляем протокол хирургической имплантации постоянно пребывающего оптического окна для грудной клетки мышей, которое позволяет проводить прижизненную визуализацию легких с высоким разрешением. Постоянство окна делает его хорошо подходящим для изучения динамических клеточных процессов в легких, особенно тех, которые медленно развиваются, таких как метастатическое прогрессирование диссеминированных опухолевых клеток.

Abstract

Метастазирование, на которое приходится ~ 90% смертности, связанной с раком, включает системное распространение раковых клеток из первичных опухолей во вторичные участки, такие как кость, мозг и легкие. Несмотря на то, что механистические детали этого процесса широко изучены, они остаются плохо изученными. В то время как общие методы визуализации, включая компьютерную томографию (КТ), позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) и магнитно-резонансную томографию (МРТ), предлагают различную степень грубой визуализации, каждому из них не хватает временного и пространственного разрешения, необходимого для обнаружения динамики отдельных опухолевых клеток. Чтобы решить эту проблему, были описаны многочисленные методы для прижизненной визуализации общих метастатических участков. Из этих участков легкие оказались особенно сложными для доступа к прижизненной визуализации из-за его деликатности и критической роли в поддержании жизни. Хотя ранее было описано несколько подходов для одноклеточной прижизненной визуализации интактного легкого, все они включают высокоинвазивные и терминальные процедуры, ограничивающие максимально возможную продолжительность визуализации до 6-12 ч. Здесь описана улучшенная методика перманентной имплантации минимально инвазивного грудного оптического окна для визуализации легких с высоким разрешением (WHRIL). В сочетании с адаптированным подходом к микрокартографии инновационное оптическое окно облегчает последовательную прижизненную визуализацию неповрежденного легкого с одноклеточным разрешением в течение нескольких сеансов визуализации и в течение нескольких недель. Учитывая беспрецедентную продолжительность времени, в течение которого данные визуализации могут быть собраны, WHRIL может способствовать ускоренному открытию динамических механизмов, лежащих в основе метастатического прогрессирования и многочисленных дополнительных биологических процессов в легких.

Introduction

Ответственные за ~ 90% смертей, метастазы являются основной причиной смертности, связанной с раком^1. Среди основных участков клинически наблюдаемых метастазов (кости, печень, легкие, мозг)^2,легкие оказались особенно сложными для визуализации in vivo с помощью прижизненной микроскопии. Это связано с тем, что легкое является тонким органом в вечном движении. Непрерывное движение легких, дополнительно усугубляемое внутригрудным сердечным движением, представляет собой существенный барьер для точной визуализации. Поэтому из-за его относительной недоступности для модальностей для прижизненной оптической визуализации с высоким разрешением рост рака в легких часто считается оккультным процессом^3.

В клинических условиях технологии визуализации, такие как компьютерная томография (КТ), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ), позволяют визуализировать глубоко внутри интактных жизненно важных органов, таких как легкие^4. Однако, хотя эти модальности обеспечивают превосходный вид грубого органа (часто даже выявляя патологию до появления клинических симптомов), они имеют недостаточное разрешение для обнаружения отдельных диссеминированных опухолевых клеток по мере их продвижения через ранние стадии метастазирования. Следовательно, к тому времени, когда вышеупомянутые модальности дают какие-либо признаки метастазирования в легкие, метастатические очаги уже хорошо укоренились и размножаются. Поскольку микроокружение опухоли играет ключевую роль в прогрессировании рака и образовании метастазов^5,6,существует большой интерес к исследованию самых ранних этапов метастатического посева in vivo. Этот интерес дополнительно подпитывается повышенным пониманием того, что раковые клетки распространяются еще до того, как первичная опухоль обнаружена^7,8, и растущими доказательствами того, что они выживают как одиночные клетки и находятся в спящем состоянии в течение многих лет или десятилетий, прежде чем перерасти в макрометастаз^9.

Ранее визуализация легких при одноклеточном разрешении обязательно включала ex vivo или эксплант препараты^10,11,12,13,ограничивая анализы одиночными временными точками. Хотя эти препараты предоставляют полезную информацию, они не дают никакого представления о динамике опухолевых клеток в органе, связанном с неповрежденной кровеносной системой.

Последние технологические достижения в области визуализации позволили интравитальной визуализации неповрежденного легкого с одноклеточным разрешением в течение периодов до 12 ч^14,15,16. Это было достигнуто в мышиной модели с использованием протокола, который включал механическую вентиляцию, резекцию грудной клетки и вакуумную иммобилизацию легких. Однако, несмотря на то, что он предлагает первые изображения физиологически неповрежденного легкого с разрешением одной клетки, этот метод является высокоинвазивным и терминальным, что исключает дальнейшие сеансы визуализации за пределами индексной процедуры. Это ограничение, таким образом, препятствует его применению для изучения метастатических стадий, которые занимают более 12 ч, таких как покоя и реинициация роста^14,15,16. Кроме того, паттерны клеточного поведения, наблюдаемые с использованием этого подхода к визуализации, должны быть осторожно интерпретированы, учитывая, что вызванные вакуумом перепады давления, вероятно, вызовут отклонения в кровотоке.

Чтобы преодолеть эти ограничения, недавно было разработано минимально инвазивное окно для визуализации легких с высоким разрешением (WHRIL), облегчающее последовательную визуализацию в течение длительного периода от нескольких дней до недель без необходимости механической вентиляции^17. Методика влечет за собой создание «прозрачной грудной клетки» с герметичной грудной полостью для сохранения нормальной функции легких. Процедура хорошо переносится, что позволяет мыши восстанавливаться без значимых изменений в исходной активности и функции. Чтобы надежно локализовать одну и ту же область легких на каждом соответствующем сеансе визуализации, к этому окну¹⁸был применен метод, известный как микрокартография. Через это окно можно было захватывать изображения клеток, когда они поступают в сосудистое русло легкого, пересекают эндотелий, проходят деление клеток и превращаются в микрометастазы.

Здесь в исследовании представлено подробное описание улучшенного хирургического протокола имплантации WHRIL, который упрощает операцию, одновременно повышая ее воспроизводимость и качество. Хотя этот протокол был разработан для исследования динамических процессов, лежащих в основе метастазирования, этот метод может быть альтернативно применен к исследованиям многочисленных процессов биологии легких и патологии.

Protocol

Все процедуры, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами использования позвоночных животных, включая предварительное одобрение Комитета по институциональному уходу и использованию животных Медицинского колледжа Альберта Эйнште…

Representative Results

Этапы хирургической процедуры, описанные в этом протоколе, обобщены и проиллюстрированы на рисунке 1. Вкратце, перед операцией мышей обезболивают и удаляют волосы над левой грудной клеткой. Мышей интубируют и механически вентилируют, чтобы обеспечить выживание при нар…

Discussion

В местах отдаленного метастазирования, таких как легкие, оптическая визуализация с высоким разрешением дает представление о сложной динамике метастазирования опухолевых клеток. Обеспечивая визуализацию in vivo отдельных раковых клеток и их взаимодействия с тканью хозяина, прижизн…

Materials

1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	N/A	concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres	Invitrogen	F8827
5 mm coverslip	Electron Microscopy Sciences	72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
5% Isoflurane	Henry Schein, Inc	29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle	Ethicon, Inc.	774B
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275
8 mm stainless steel window frame	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie	Ethicon, Inc.	LA55G
5 mm disposable biopsy punch	Integra	33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors	Roboz	RS-5980
Buprenorphine	Hospira	0409-2012-32
Cautery pen	Braintree Scientific	GEM 5917
Chlorhexidine gluconate	Becton, Dickinson and Company	260100	ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive	Henkel Adhesives	LOC1363589
Fiber-optic illuminator	O.C. White Company	FL3000
Bead sterilizer	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Germinator 500
Graefe forceps	Roboz	RS-5135
Infrared heat lamp	Braintree Scientific	HL-1
Insulin syringes	Becton Dickinson	329424
Isoflurane vaporizer	SurgiVet	VCT302
Jacobson needle holder with lock	Kalson Surgical	T1-140
Long cotton tip applicators	Medline Industries	MDS202055
Nair	Church & Dwight Co., Inc.	40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin	Johnson & Johnson	501373005	Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
Paper tape	Fisher Scientific	S68702
Murine ventilator	Kent Scientific	PS-02	PhysioSuite
Rectangular Cover Glass	Corning	2980-225
Rodent intubation stand	Braintree Scientific	RIS 100
Small animal lung inflation bulb	Harvard Apparatus	72-9083
Stainless steel cutting tool	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic	Hi-Tech Pharmacal Co.	50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming	Kent Scientific	SURGI-M02	Heated surgical platform
Tracheal catheter	Exelint International	26746	22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe	Ted Pella, Inc.	528-112