폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창
Summary
여기에서, 우리는 폐의 고해상도, 인트라비티 이미징을 가능하게 하는 뮤린 흉부에 대한 영구적으로 깃드는 광학 창의 외과 이식을 위한 프로토콜을 제시합니다. 창의 영속성은 폐에 있는 동적 세포 프로세스의 연구 결과, 특히 보급된 종양 세포의 전이성 진행과 같이 천천히 진화하는 그들에 적합합니다.
Abstract
암 관련 사망률의 ~90%를 차지하는 전이는 1차 종양에서 뼈, 뇌 및 폐와 같은 이차 부위에 암세포의 전신 확산을 수반합니다. 광범위하게 연구되었지만,이 과정의 기계학적 세부 사항은 제대로 이해되지 않습니다. 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI)을 포함한 일반적인 이미징 양식은 다양한 정도의 총 시각화를 제공하지만, 각 단계는 개별 종양 세포의 역학을 감지하는 데 필요한 시간적 및 공간 적 해상도가 부족합니다. 이 문제를 해결하기 위해 일반적인 전이성 부위의 인트라비티 이미징에 대해 수많은 기술이 설명되어 왔습니다. 이 사이트의, 폐는 생활을 지탱에 있는 그것의 섬세하고 중요한 역할 때문에 인트라생명 화상 진찰을 위해 접근하는 특히 도전적인 입증되었습니다. 몇몇 접근은 이전에 그대로 폐의 단하나 세포 인트라바이탈 화상 진찰을 위해 기술되었더라도, 모두는 6-12 시간으로 가능한 최대 화상 진찰 기간을 제한하는 고도로 침습적이고 말단 절차를 관련시킵니다. 여기에 설명된 폐(WHRIL)의 고분해능 이미징을 위한 최소 침습성 흉부 광학 창의 영구 이식을 위한 향상된 기술이다. 마이크로 카르타포그래피에 적응된 접근법과 결합된 혁신적인 광학 창은 여러 이미징 세션과 여러 주에 걸쳐 단일 세포 해상도에서 그대로 폐의 직렬 적인 인내 이미징을 용이하게 합니다. 화상 진찰 데이터를 수집할 수 있는 전례없는 시간 기간을 감안할 때, WHRIL는 전이성 진행의 근본적인 동적 기계장치 및 폐 내의 수많은 추가 생물학 프로세스의 가속된 발견을 용이하게 할 수 있습니다.
Introduction
사망의 ~90%를 담당하는 전이는 암 관련 사망률1의주요 원인이다. 임상관찰된 전이(뼈, 간, 폐, 뇌)2의주요 부위 중, 폐는 생체 내 현미경 검사를 통해 생체 내 이미징에 특히 도전적임을 입증하였다. 이것은 폐가 영구적 인 움직임에 섬세한 기관이기 때문이다. 폐의 지속적인 움직임은 내구 심장 운동에 의해 더 복합, 정확한 이미징에 상당한 장벽을 나타냅니다. 따라서, 고해상도 인트라비티 광학 이미징을 위한 양상에 대한 상대적 접근성으로 인해 폐 내의 암 성장은 종종 신비한 과정3으로간주되었다.
임상 환경에서는, 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI)과 같은 이미징 기술은 폐4와같은 온전한 생명 기관 내에서 깊은 시각화를 가능하게 한다. 그러나, 이 양식은 총 기관의 우수한 전망을 제공하지만 (종종 임상 증상의 발병 전에 병리학을 드러내는 것), 그들은 전이의 초기 단계를 통해 진행으로 개별 보급 종양 세포를 검출하는 부적절한 해상도입니다. 따라서 앞서 언급한 양식이 폐에 전이의 징후를 제공할 때, 전이성 포시는 이미 잘 확립되고 확산되고 있다. 종양 미세환경은 암 진행및 전이형성에중추적인 역할을 하기 때문에5,6,생체 내에서 전이성 파종의 초기 단계를 조사하는 데 큰 관심이 있다. 이러한 관심은 1차 종양이 검출되기 전에암세포가 보급된다는 인식이 높아짐에 따라 더욱 높아지고있으며,1차 종양이 검출되기전에도 7,8, 그리고 매크로 전이9로 나아지기 전에 1세포와 휴면 상태에서 수십 년 동안 생존한다는 증거가 증가하고있다.
이전에는 단일 세포 해상도에서 폐의 이미징은 반드시 전 생체 내 또는 각성제제(10,11,12,13)를포함하여 단일 시점으로 분석을 제한하고 있다. 이 준비는 유용한 정보를 제공하는 동안, 그들은 그대로 순환 시스템에 연결된 기관 내의 종양 세포의 역학에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다.
이미징의 최근 기술 발전은 최대 12h14,15,16의기간 동안 단세포 해상도에서 그대로 폐의 생명 내 시각화를 가능하게했다. 이것은 기계 환기, 흉곽의 절제술 및 진공 보조 폐 고정을 포함하는 프로토콜을 사용하여 뮤린 모델에서 달성되었습니다. 그러나, 생리학적으로 전형적인 폐의 첫 번째 단일 세포 분해성 영상을 제공했음에도 불구하고, 이 기술은 매우 침습적이고 말단이며, 따라서 인덱스 절차를 넘어 추가 이미징 세션을 배제한다. 따라서 이러한 제한은14,15,16의휴면 및 재개시와 같이 12h 이상 걸리는 전이성 단계의 연구에 적용되지 않습니다. 또한, 이 화상 진찰 접근을 사용하여 관찰된 세포 행동의 패턴은 진공 유도된 압력 차동이 혈류량에 있는 우회를 일으키는 원인이 되기 위하여 확률이 높다는 것을 감안할 때, 신중하게 해석되어야 합니다.
이러한 한계를 극복하기 위해, 폐의 고해상도 이미징을 위한 최소 침습창(WHRIL)이 최근에 개발되어 기계적환기(17)를필요로 하지 않고 며칠에서 몇 주 동안 연쇄 이미징을 용이하게 한다. 이 기술은 정상적인 폐 기능의 보존을 위해 밀봉 된 흉부 구멍이있는 ‘투명 흉곽’의 생성을 수반합니다. 절차는 잘 용납되어 마우스가 기준 활동 및 함수를 의미있게 변경하지 않고 복구할 수 있도록 합니다. 각 각 이미징 세션에서 정확히 동일한 폐 영역을 안정적으로 지역화하기 위해, 마이크로카르타포그래피로 알려진 기술이 이창(18)에적용되었다. 이 창을 통해 폐의 혈관 침대에 도착하여 내피를 건너 세포 분열을 겪고 미세 전이로 성장함에 따라 세포의 이미지를 캡처 할 수있었습니다.
여기서, 연구 결과는 그것의 재현성과 질을 증가하는 동시에 수술을 단순화하는 WHRIL의 이식을 위한 향상된 수술 프로토콜의 상세한 설명을 제시합니다. 이 프로토콜은 전이의 근본적인 동적 프로세스의 조사를 가능하게 하기 위하여 디자인된 동안, 기술은 폐 생물학과 병리학의 수많은 프로세스의 조사에 대안적으로 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
폐와 같은 먼 전이의 사이트에서 고해상도 광학 이미징은 종양 세포 전이의 정교한 역학에 대한 통찰력을 제공합니다. 단일 암 세포의 생체 내 시각화와 숙주 조직과의 상호 작용을 가능하게 함으로써 고해상도 인트라바이탈 이미징은 전이의 근본적인 메커니즘을 이해하는 데 중요한 역할을 입증했습니다.
여기에 설명된 고해상도 다광자 현미경 검사를 통해 뮤린 폐?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다: CA216248, CA01330, 몬테피오레의 루스 L. Kirschstein T32 교육 보조금 CA200561, 메타비보 초기 경력 상, 그루스 – 리퍼 바이오 포토닉스 센터와 통합 이미징 프로그램, 제인 A. 아인슈타인 의과 대학의 분석 영상 시설(AIF)에 이미징 지원을 부탁드립니다.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
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