Una ventana permanente para investigar la metástasis del cáncer en el pulmón
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanentemente permanente para el tórax murino, que permite obtener imágenes intravitales de alta resolución del pulmón. La permanencia de la ventana la hace muy adecuada para el estudio de los procesos celulares dinámicos en el pulmón, especialmente aquellos que evolucionan lentamente, como la progresión metastásica de las células tumorales diseminadas.
Abstract
La metástasis, que representa ~ 90% de la mortalidad relacionada con el cáncer, implica la propagación sistémica de las células cancerosas desde tumores primarios a sitios secundarios como el hueso, el cerebro y el pulmón. Aunque ampliamente estudiados, los detalles mecanicistas de este proceso siguen siendo poco conocidos. Si bien las modalidades de imágenes comunes, incluida la tomografía computarizada (TC), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (IRM), ofrecen diversos grados de visualización macroscópica, cada una carece de la resolución temporal y espacial necesaria para detectar la dinámica de las células tumorales individuales. Para abordar esto, se han descrito numerosas técnicas para la obtención de imágenes intravitales de sitios metastásicos comunes. De estos sitios, el pulmón ha demostrado ser especialmente difícil de acceder para las imágenes intravitales debido a su delicadeza y papel crítico en el mantenimiento de la vida. Aunque se han descrito previamente varios enfoques para la obtención de imágenes intravitales unicelulares del pulmón intacto, todos implican procedimientos altamente invasivos y terminales, lo que limita la duración máxima posible de la imagen a 6-12 h. Aquí se describe una técnica mejorada para la implantación permanente de una ventana óptica torácica mínimamente invasiva para imágenes de alta resolución del pulmón (WHRIL). Combinada con un enfoque adaptado a la microcartografía, la innovadora ventana óptica facilita la obtención de imágenes intravitales en serie del pulmón intacto a resolución de una sola célula en múltiples sesiones de imágenes y que abarcan varias semanas. Dada la duración sin precedentes durante el cual se pueden recopilar datos de imágenes, el WHRIL puede facilitar el descubrimiento acelerado de los mecanismos dinámicos subyacentes a la progresión metastásica y numerosos procesos biológicos adicionales dentro del pulmón.
Introduction
Responsable de ~ 90% de las muertes, la metástasis es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer1. Entre los principales sitios de metástasis clínicamente observados (hueso, hígado, pulmón, cerebro)2, el pulmón ha demostrado ser particularmente desafiante para las imágenes in vivo a través de microscopía intravital. Esto se debe a que el pulmón es un órgano delicado en movimiento perpetuo. El movimiento continuo de los pulmones, agravado aún más por el movimiento cardíaco intratorácico, representa una barrera sustancial para obtener imágenes precisas. Por lo tanto, debido a su relativa inaccesibilidad a las modalidades de imágenes ópticas intravitales de alta resolución, el crecimiento del cáncer dentro del pulmón a menudo se ha considerado un proceso oculto3.
En el entorno clínico, las tecnologías de imagen como la tomografía computarizada (TC), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (IRM) permiten la visualización en lo profundo de órganos vitales intactos como el pulmón4. Sin embargo, si bien estas modalidades proporcionan excelentes vistas del órgano grueso (a menudo incluso revelando patología antes de la aparición de los síntomas clínicos), son de resolución inadecuada para detectar células tumorales diseminadas individuales a medida que avanzan a través de las primeras etapas de la metástasis. En consecuencia, en el momento en que las modalidades antes mencionadas proporcionan cualquier indicación de metástasis al pulmón, los focos metastásicos ya están bien establecidos y proliferan. Dado que el microambiente tumoral juega un papel fundamental en la progresión del cáncer y la formación de metástasis5,6, existe un gran interés en investigar los primeros pasos de la siembra metastásica in vivo. Este interés se alimenta aún más por la mayor apreciación de que las células cancerosas se diseminan incluso antes de que se detecte el tumor primario7,8 y la creciente evidencia de que sobreviven como células individuales y en un estado latente durante años o décadas antes de crecer en macrometástasis9.
Anteriormente, la obtención de imágenes del pulmón a resolución unicelular ha implicado necesariamente preparaciones ex vivo o explante10,11,12,13,limitando los análisis a puntos de tiempo únicos. Si bien estas preparaciones proporcionan información útil, no proporcionan ninguna idea de la dinámica de las células tumorales dentro del órgano conectado a un sistema circulatorio intacto.
Los recientes avances tecnológicos en imágenes han permitido la visualización intravital del pulmón intacto a resolución unicelular durante períodos de hasta 12 h14,15,16. Esto se logró en un modelo murino utilizando un protocolo que involucró ventilación mecánica, resección de la caja torácica e inmovilización pulmonar asistida por vacío. Sin embargo, a pesar de ofrecer las primeras imágenes de resolución celular única del pulmón fisiológicamente intacto, la técnica es altamente invasiva y terminal, lo que impide más sesiones de imágenes más allá del procedimiento índice. Esta limitación, por tanto, impide su aplicación al estudio de pasos metastásicos que tardan más de 12 h, como la latencia y el reinicio del crecimiento14,15,16. Además, los patrones de comportamiento celular observados utilizando este enfoque de imágenes deben interpretarse con cautela, dado que es probable que los diferenciales de presión inducidos por el vacío causen desviaciones en el flujo sanguíneo.
Para superar estas limitaciones, recientemente se desarrolló una Ventana mínimamente invasiva para imágenes de alta resolución del pulmón (WHRIL), que facilita la obtención de imágenes en serie durante un período prolongado de días a semanas, sin necesidad de ventilación mecánica17. La técnica consiste en la creación de una “caja torácica transparente” con una cavidad torácica sellada para la preservación de la función pulmonar normal. El procedimiento es bien tolerado, lo que permite que el ratón se recupere sin alteraciones significativas en la actividad y función basales. Para localizar de forma fiable exactamente la misma región pulmonar en cada sesión de imagen respectiva, se aplicó a esta ventana una técnica conocida como microcartografía18. A través de esta ventana, fue posible capturar imágenes de células a medida que llegan al lecho vascular del pulmón, cruzan el endotelio, se dividen celularmente y crecen en micrometástasis.
Aquí, el estudio presenta una descripción detallada de un protocolo quirúrgico mejorado para la implantación del WHRIL, que simplifica la cirugía al tiempo que aumenta su reproducibilidad y calidad. Si bien este protocolo fue diseñado para permitir la investigación de los procesos dinámicos subyacentes a la metástasis, la técnica puede aplicarse alternativamente a las investigaciones de numerosos procesos de biología y patología pulmonar.
Protocol
Representative Results
Discussion
En sitios de metástasis a distancia, como el pulmón, las imágenes ópticas de alta resolución proporcionan información sobre la dinámica elaborada de la metástasis de las células tumorales. Al permitir la visualización in vivo de células cancerosas individuales y sus interacciones con el tejido huésped, las imágenes intravitales de alta resolución han demostrado ser fundamentales para comprender los mecanismos subyacentes a la metástasis.
Aquí se describe un protocolo q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561 de Montefiore, METAvivor Early Career Award, el Centro de Biofotónica Gruss-Lipper y su Programa integrado de imágenes, y Jane A. y Myles P. Dempsey. Nos gustaría agradecer al Centro de Imágenes Analíticas (AIF) en la Facultad de Medicina Einstein por el apoyo de imágenes.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D. Classification of lung cancer. Seminars in Roentgenology. 46 (3), 178-186 (2011).
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E. Endobronchial metastasis. Archives of Internal Medicine. 135 (4), 543-547 (1975).
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D. Lung metastases. European Radiology. 6 (5), 596-606 (1996).
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P. ImageJ plugin HyperStackReg V5.6. Zenodo. , (2018).
