肺への癌転移を調査するための永久的な窓
Summary
ここでは、肺の高解像度の生体内イメージングを可能にするマウス胸郭用の永久に留置された光学窓の外科的移植のためのプロトコルを提示する。ウィンドウの永続性は、肺の動的細胞プロセス、特に播種された腫瘍細胞の転移進行など、ゆっくりと進化している細胞プロセスの研究に適しています。
Abstract
転移は、がん関連死亡率の90%を占め、原発性腫瘍から骨、脳、肺などの二次部位への癌細胞の全身的な広がりを伴う。広範囲に研究されているが、このプロセスの機械主義的な詳細は十分に理解されていない。コンピュータ断層撮影(CT)、陽電子放出断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)を含む一般的なイメージングモダリティは、様々な程度の総可視化を提供しますが、それぞれが個々の腫瘍細胞のダイナミクスを検出するために必要な時間的および空間的解像度を欠いています。これに対処するために、一般的な転移部位の生体内イメージングに関する多数の技術が説明されている。これらの部位のうち、肺は生命を維持する上での繊細さと重要な役割のために、生体内画像へのアクセスに特に困難であることが証明されている。インタクトな肺の単一細胞内生体イメージングにはいくつかのアプローチが以前に記載されているが、すべて非常に侵襲性および末期の手順を伴い、可能な限り最大のイメージング期間を6〜12時間に制限する。ここで説明する、肺の高解像度イメージングのための低侵襲胸部光学窓(WHRIL)の恒久的な移植のための改良された技術である。マイクロカートグラフィーに適応したアプローチと組み合わせることで、革新的な光学窓は、複数のイメージングセッションにわたって単一細胞解像度で無傷の肺の連続的なインビタルイメージングを容易にし、数週間にわたる。イメージングデータを収集できる前例のない時間を考えると、WHRILは、転移性の進行と肺内の多数の追加の生物学的プロセスの基礎となる動的メカニズムの加速的発見を促進することができます。
Introduction
死亡の90%を占める、転移は癌関連死亡率の主な原因である1。臨床的に観察された転移(骨、肝臓、肺、脳)2の主要部位の中で、肺は、生体内顕微鏡による 生体内 イメージングに特に挑戦的であることが証明されている。これは、肺が永久的な動きの繊細な器官であるためです。肺の連続運動は、胸腔内心臓運動によってさらに複合され、正確な画像化に対する実質的な障壁を表す。したがって、高解像性生体内光学画像化のためのモダリティに対する相対的なアクセス不能のために、肺内の癌増殖は、しばしばオカルトプロセス3とみなされてきた。
臨床現場では、コンピュータ断層撮影(CT)、陽電子放射断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)などの画像技術により、肺4などのインタクトな重要な器官の奥深くで可視化が可能になる。しかし、これらのモダリティは、グロス臓器の優れた見解を提供するが(多くの場合、臨床症状の発症前に病理を明らかにすることさえある)、転移の初期段階を進める個々の播種腫瘍細胞を検出するには不十分な分解能である。その結果、前述のモダリティが肺に転移の兆候を提供する時点で、転移性病巣はすでに十分に確立され増殖している。腫瘍微小環境は癌進行及び転移形成5,6において極めて重要な役割を果たすため、生体内で転移性播種の最も早いステップを調査することに大きな関心がある。この関心は、原発性腫瘍が検出される前でさえ癌細胞が広まることの増加の評価によってさらに促進される7,8そしてそれらがマクロ転移に成長する前に数十年から数十年休眠状態で生き残る証拠を増加させる9.
以前は、単一細胞分解能での肺のイメージングは、必ずしも10、11、12、13のex vivoまたは外植の調製を伴い、分析を単一の時点に制限していた。これらの調製物は有用な情報を提供するが、それらは無傷の循環系に接続された器官内の腫瘍細胞のダイナミクスに関する洞察を提供しない。
イメージングにおける最近の技術の進歩により、12時間14、15、16までの期間にわたって単一細胞分解能で無傷の肺の生体内可視化が可能になった。これは、機械的換気、胸部の切除、真空支援肺固定化を含むプロトコルを使用してマウスモデルで達成された。しかし、生理学的に無傷の肺の最初の単一細胞分解能画像を提供したにもかかわらず、この技術は非常に侵襲性および末端であり、それによって、インデックス手順を超えてさらなるイメージングセッションを排除する。この制限は、従って、12時間を超える転移ステップの研究への応用を妨げる、例えば、休止状態および成長14、15、16の再開始などである。さらに、このイメージング手法を用いて観察された細胞行動のパターンは、真空による圧力差が血流の転換を引き起こす可能性があることを考えると、慎重に解釈されなければならない。
これらの制限を克服するために、肺の高解像度イメージングのための低侵襲窓(WHRIL)が最近開発され、機械的換気を必要とせずに、数日間から数週間にわたって連続画像化を促進する。この技術は、正常な肺機能の保存のための密閉胸腔を有する「透明な胸部」の作成を伴う。この手順は十分に許容され、ベースラインの活動と機能を意味のある変更なしにマウスが回復することを可能にする。それぞれのイメージングセッションで全く同じ肺領域を確実に局地化するために、マイクロカートグラフィとして知られる技術をこの窓18に適用した。この窓を通して、肺の血管床に到着し、内皮を横切り、細胞分裂を受け、微小転移に成長する細胞の画像を捕捉することが可能であった。
ここでは、WHRILの移植のための改善された外科プロトコルの詳細な説明を提示し、同時にその再現性と品質を高めながら手術を簡素化する。このプロトコルは転移の根底にある動的プロセスの調査を可能にするように設計されたが、この技術は肺生物学および病理学の多数のプロセスの調査に代わり適用されるかもしれない。
Protocol
Representative Results
Discussion
肺などの遠隔転移部位では、高解像光学イメージングは、腫瘍細胞転移の精巧なダイナミクスに関する洞察を提供する。単一癌細胞の 生体内 可視化と宿主組織との相互作用を可能にすることにより、高解像インビタルイメージングは、転移の根底にあるメカニズムを理解するのに役立つ証明された。
ここで説明する、高解像多光子顕微鏡を介してマウス肺の連続…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、CA216248、CA013330、モンテフィオーレのルースL.キルシュシュタインT32トレーニンググラントCA200561、METAvivorアーリーキャリア賞、グルースリッパーバイオフォトニクスセンターとその統合イメージングプログラム、ジェーンA.とマイレスP.アインシュタイン医科大学の分析イメージング施設(AIF)にイメージングサポートを感謝申し上げます。
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
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