הדמיה וניתוח אוטומטיים לכימות של מקרופינומיסומים המסומנים בפלואורסצנטות
Summary
בדיקות אוטומטיות באמצעות מיקרו-פלטות מרובות היטב הן גישות מועילות לזיהוי רגולטורים של מסלולים בכך שהן מאפשרות הערכה של מספר רב של תנאים בניסוי אחד. כאן, התאמנו את פרוטוקול ההדמיה והכימות של המקרופינום המבוסס היטב לפורמט מיקרו-לוחית של 96 בארות ומספקים מתאר מקיף לאוטומציה באמצעות קורא לוחות רב-מצבי.
Abstract
Macropinocytosis הוא מסלול ספיגה לא ספציפי של שלב הנוזלים המאפשר לתאים להפנים מטען חוץ-תאי גדול, כגון חלבונים, פתוגנים ופסולת תאים, באמצעות אנדוציטוזיס בתפזורת. מסלול זה ממלא תפקיד חיוני במגוון תהליכים תאיים, כולל ויסות תגובות חיסוניות וחילוף חומרים של תאים סרטניים. בהתחשב בחשיבות זו בתפקוד הביולוגי, בחינת תנאי תרבית התאים יכולה לספק מידע רב ערך על ידי זיהוי רגולטורים של מסלול זה ואופטימיזציה של תנאים להיות מועסקים בגילוי גישות טיפוליות חדשניות. המחקר מתאר טכניקת הדמיה וניתוח אוטומטית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי וקורא לוחות רב-מצבי הדמיית תאים לכימות המהיר של האינדקס המקרופאינוציטי בתאים דבקים. השיטה האוטומטית מבוססת על ספיגת dextran פלואורסצנטי במשקל מולקולרי גבוה וניתן ליישם אותה על מיקרופלסטיק 96-well כדי להקל על הערכות של תנאים מרובים בניסוי אחד או דגימות קבועות המותקנות על כיסויי זכוכית. גישה זו נועדה למקסם את הרבייה ולהפחית את השונות הניסיונית תוך חיסכון בזמן וחסכוני.
Introduction
המסלול האנדוציטי הלא ספציפי של מקרופינוציטוזיס מאפשר לתאים להפנים מגוון רכיבים חוץ-תאיים, כולל חומרים מזינים, חלבונים, אנטיגנים ופתוגנים, באמצעות ספיגה בתפזורת של נוזל חוץ-תאי ומרכיביו1. למרות חשוב עבור הביולוגיה של סוגי תאים רבים, יותר ויותר, מסלול macropinocytosis מתואר לשחק תפקיד חיוני בביולוגיה של הגידול, שבו, באמצעות ספיגה macropinocytic, תאים סרטניים מסוגלים לשרוד ולהתרבות בנוכחות microenvironment מזין מדולדל2,3. ספיגת מקרומולקולות חוץ-תאיות, כולל אלבומין ומטריצה חוץ-תאית, ופסולת תאים נמקיים, מספקת מקור מזין חלופי לייצור ביומסה על ידי יצירת חומצות אמינו, סוכרים, שומנים ונוקלאוטידים באמצעות מקרופינוזה ו-lysosome בתיווך קטבוליזם מטען4,5,6,7,8.
האינדוקציה והרגולציה של מקרופינוציטוזה הם מורכבים ויכולים להשתנות בהתאם להקשר התאי. עד כה זוהו מספר ממריצים של מקרופינוציטוזיס וכוללים ליגנדים, כגון גורם גדילה אפידרמלי (EGF), גורם גדילה נגזר טסיות דם (PDGF), גלקטין-3, ו Wnt3A9,10,11,12,13. בנוסף, תנאי פולחן המחקים את microenvironment הגידול יכול לעורר את ההפעלה של המסלול. גידולי אדנוקרצינומה בלבלב (PDAC) סובלים ממחסור בחומרים מזינים, במיוחד עבור חומצת האמינו גלוטמין, הגורמת הן לתאים סרטניים והן לפיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) להסתמך על מקרופינוציטוזה להישרדות7,13,14,15. יתר על כן, לחצי גידול, כגון היפוקסיה ומתח חמצוני, יכול להפעיל את מסלול ניקוי זה16. בנוסף למשפיעים החיצוניים הרבים שיכולים לגרום למקרופאינוציטוזה, מגוון מסלולים תאיים שולטים בהיווצרות מקרופינום. טרנספורמציה אונקוגנית בתיווך ראס מספיקה כדי ליזום את המכונות המקרופינוציטיות, וסוגי סרטן מרובים מציגים מקרופינוציטוזיס מונחה ראס אונקוגני4,5,9,17. לחלופין, סוג פראי הפעלה ראס מסלולים עצמאיים ראס זוהו כדי להפעיל macropinocytosis בתאים סרטניים ו CAFs10,11,15,18. השימוש במודלים שונים של הפריה חוץ גופית בשילוב עם טיפולים מעכבים הביא לזיהוי של מספר אפננים macropinocytosis, הכוללים מחליפי נתרן-מימן, GTPase Rac1 קטן, זרחן phosphoinositide 3-קינאז (PI3K), קינאז מופעל p21 (Pak), וקינאז חלבון מופעל AMP (AMPK)4,13,15 . עם זאת, בהתחשב בשפע של גורמים ותנאים המתוארים המסדירים macropinocytosis, זה מתקבל על הדעת כי הרבה יותר אפננים וגירויים להישאר לא ידוע. זיהוי של אפננים וגירויים חדשניים יכול להיות קל על ידי הערכה אוטומטית של שפע של תנאים בניסוי אחד. מתודולוגיה זו יכולה לשפוך אור על הגורמים המעורבים בהיווצרות מקרופינום ועשויה לאפשר גילוי של מולקולות קטנות או ביולוגיות חדשניות המכוונות למסלול זה.
כאן, התאמנו את הפרוטוקול שלנו שהוקם בעבר לקביעת היקף המקרופאינוציטוזיס בתאי סרטן במבחנה לפורמט מיקרו-פלטה של 96 well והדמיה וכימות אוטומטיים19,20. פרוטוקול זה מבוסס על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, שהפכה לסטנדרט בתחום לקביעת מקרופינוציטוזיס במבחנה וב– vivo4,5,6,7,9,10,11,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. ניתן להבחין בין מקרופינומיסומים למסלולים אנדוציטיים אחרים באמצעות יכולתם להפנים מקרומולקולות גדולות, כגון דקסטרן במשקל מולקולרי גבוה (כלומר, 70 kDa)2,3,4,20,20,21,22,23. לכן, מקרופינוזומים ניתן להגדיר באמצעות ספיגה של פלואורופור מנוהל מחוץ לתאים שכותרתו 70 kDa dextran. כתוצאה מכך, שלפוחיות מקרופינוציטיות מתבטאות כאשכולות תאיים של פונקטה פלואורסצנטית בגדלים הנעים בין 0.2-5 מיקרומטר. אלה puncta ניתן לדמיין מיקרוסקופי ולאחר מכן לכמת כדי לקבוע את מידת macropinocytosis בתא – “אינדקס macropinocytic”.
בפרוטוקול זה מתוארים השלבים החיוניים להדמיית מקרופינומיסמים בתאים דביקים במבחנה על לוחית מיקרו-פלטה בת 96 well וכיסויים באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי (איור 1).” בנוסף, ההוראות להפוך את רכישת התמונה לאוטומטית וכימות האינדקס המקרו-פינוציטי באמצעות קורא לוחות מרובה מצבים הדמיה תא מסופקים. אוטומציה זו מפחיתה את הזמן, העלות והמאמץ בהשוואה לפרוטוקולים שתוארו בעבר19,20. בנוסף, הוא נמנע מרכישה וניתוח הדמיה מוטה בשוגג ובכך משפר את יכולת הרבייה והאמינות. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לסוגי תאים שונים או קוראי לוחות או להיות מנוצלת כדי לקבוע תכונות מקרופינום חלופיות, כגון גודל, מספר ומיקום. השיטה המתוארת להלן מתאימה במיוחד לסינון של תנאי תרבית התא הגורמים macropinocytosis, זיהוי של אפננים חדשים, או אופטימיזציה של ריכוזי סמים של מעכבים ידועים.
איור 1: סכמטי של הבדיקה האוטומטית כדי לקבוע את ‘האינדקס המקרו-פינוציטי’ בתאים דבקים. נוצר באמצעות BioRender. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
איכות הניסויים ורכישת הנתונים תלויה מאוד באיכות הריאגנטים, באופטימיזציה של ההגדרות ובניקיון כיסויי הכיסוי והמיקרו-לוחית. התוצאות הסופיות צריכות לתת שונות מינימלית בין שכפולים; עם זאת, שינויים ביולוגיים מתרחשים באופן טבעי או עלולים להיגרם בדרך אחרת על ידי מספר גורמים. צפיפות תאים עלולה ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH / NCI (R01CA207189, R21CA243701) ל- C.C. KMO.G. הוא מקבל פרס מלגת פוסט-דוקטורט TRDRP (T30FT0952). BioTek Cytation 5 הוא חלק מליבת הדמיית התאים של סנפורד ברנהם פרביס, המקבלת תמיכה כספית ממענק התמיכה של מרכז הסרטן NCI (P30 CA030199). איורים 1-3 נוצרו באמצעות BioRender.
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25053CI | 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL Centrifuge tube | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L Beaker | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24-well Tissue culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL Reagent reservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 mL Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8-Channel aspiration adapter | Integra Biosciences | 155503 | |
| 8-Channel aspiration adapter for standard tips | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Ammonia-free glass cleaner | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96-well high-content screening microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Cotton-tipped applicator | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12 mm diameter |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa – FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
| Dextran 70 kDa – TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | Without Calcium and Magnesium |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Formaldehyde, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
| Hardening fluorescence mounting media | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certified ACS Plus, 36.5%–38.0% |
| Lint-free wipes | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | Premium plain glass |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10013 | 8 channels, 0.5–10 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10012 | 12 channels, 20–200 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10011 | 8 channels, 20–200 µL |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Plastic wrap | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Silicone isolators | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm |
| Slide adapter | Biotek | 1220548 | |
| Wash bottle | Fisherbrand | FB0340922C |
References
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21 (2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Zhang, Y. J., Commisso, C. Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network. Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
- Olivares, O., et al. Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions. Nature Communications. 8, (2017).
- Seguin, L., et al. Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers. Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).
- Redelman-Sidi, G., et al. The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer. Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).
- Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).
- Schmees, C., et al. Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).
- Lee, S. -. W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).
- Recouvreux, M. V., et al. Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).
- Su, H., et al. Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis. Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).
- Mishra, R., et al. Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming. Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).
- Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. Macropinosome quantitation assay. MethodsX. 1, 36-41 (2014).
- Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
