Automatisert avbildning og analyse for kvantifisering av fluorescerende merkede makropinosomer

Summary

Automatiserte analyser ved bruk av mikroplater med flere brønner er fordelaktige tilnærminger for å identifisere veiregulatorer ved å tillate vurdering av en rekke forhold i et enkelt eksperiment. Her har vi tilpasset den veletablerte makropinosomavbildnings- og kvantifiseringsprotokollen til et 96-brønns mikroplateformat og gir en omfattende disposisjon for automatisering ved hjelp av en flermodusplateleser.

Abstract

Makropinocytose er en ikke-spesifikk væskefaseopptaksvei som gjør det mulig for celler å internalisere stor ekstracellulær last, som proteiner, patogener og celleavfall, gjennom bulk endokytose. Denne banen spiller en viktig rolle i en rekke cellulære prosesser, inkludert regulering av immunresponser og kreftcellemetabolisme. Gitt denne betydningen i biologisk funksjon, kan undersøkelse av cellekulturforhold gi verdifull informasjon ved å identifisere regulatorer for denne veien og optimalisere forholdene som skal brukes i oppdagelsen av nye terapeutiske tilnærminger. Studien beskriver en automatisert bilde- og analyseteknikk ved hjelp av standard laboratorieutstyr og en multimodusplateleser for celleavbildning for rask kvantifisering av makropinocytisk indeks i tilhengerceller. Den automatiserte metoden er basert på opptak av fluorescerende dekstran med høy molekylvekt og kan brukes på 96-brønns mikroplater for å lette vurderinger av flere forhold i ett eksperiment eller faste prøver montert på glassdeksler. Denne tilnærmingen tar sikte på å maksimere reproduserbarhet og redusere eksperimentell variasjon samtidig som den er både tidsbesparende og kostnadseffektiv.

Introduction

Den ikke-spesifikke endokytiske banen til makropinocytose gjør det mulig for celler å internalisere en rekke ekstracellulære komponenter, inkludert næringsstoffer, proteiner, antigener og patogener, gjennom bulkopptak av ekstracellulær væske og dens ^{bestanddeler1}. Selv om det er viktig for biologien til mange celletyper, er makropinocytosebanen i økende grad beskrevet for å spille en viktig rolle i tumorbiologien, hvor tumorceller gjennom makropinocytisk opptak er i stand til å overleve og spre seg i nærvær av et næringsfattig ^{mikromiljø2,3}. Opptaket av ekstracellulære makromolekyler, inkludert albumin og ekstracellulær matrise, og nekrotisk celleavfall, gir en alternativ næringskilde for biomasseproduksjon ved å lage aminosyrer, sukker, lipider og nukleotider gjennom makropinosom og lysosomet fusjonsmediert lastkaboisme4,5,6,7,8.

Induksjonen og reguleringen av makropinocytose er kompleks og kan variere avhengig av cellulær kontekst. Så langt har flere indusere av makropinocytose blitt identifisert og inkluderer ligander, for eksempel epidermal vekstfaktor (EGF), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), galectin-3 og Wnt3A9,10,11,12,13. I tillegg kan dyrkingsforhold som etterligner tumormikromiljøet utløse aktivering av banen. Bukspyttkjertelkanal adenokarsinom (PDAC) svulster er næringsfattige, spesielt for aminosyre glutamin, noe som fører til at både kreftceller og kreftrelaterte fibroblaster (CAFs) er avhengige av makropinocytose for overlevelse7,13,14,15. Videre kan tumorspenninger, som hypoksi og oksidativt stress, aktivere denne scavenging ^pathway16. I tillegg til de mange ekstrinsiske påvirkerne som kan indusere makropinocytose, kontrollerer en rekke intracellulære veier makropinosomdannelse. Onkogen Ras-mediert transformasjon er tilstrekkelig til å initiere det makropinocytiske maskineriet, og flere krefttyper utviser onkogen Ras-drevet konstituerende makropinocytose4,5,9,17. Alternativt er villtype Ras-aktivering og Ras-uavhengige veier identifisert for å aktivere makropinocytose i kreftceller og CAFs10,11,15,18. Bruken av ulike in vitro-modeller i kombinasjon med inhibitorbehandlinger har resultert i identifisering av flere makropinocytosemodulatorer, som inkluderer natrium-hydrogenvekslere, den lille GTPase Rac1, fosfoinositid 3-kinase (PI3K), p21-aktivert kinase (Pak) og AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) ^4,13,15 . Men gitt mangfoldet av beskrevne faktorer og forhold som regulerer makropinocytose, er det tenkelig at mange flere modulatorer og stimuli forblir uoppdaget. Identifisering av nye modulatorer og stimuli kan lettes ved automatisert vurdering av en rekke forhold i et enkelt eksperiment. Denne metoden kan belyse faktorene som er involvert i makropinosomdannelse og kan tillate oppdagelsen av nye små molekyler eller biologer som retter seg mot denne veien.

Her har vi tilpasset vår tidligere etablerte protokoll for å bestemme omfanget av makropinocytose i kreftceller in vitro til et 96-brønns mikroplateformat og automatisert avbildning og kvantifisering19,20. Denne protokollen er basert på fluorescerende mikroskopi, som har blitt en standard i feltet for å bestemme makropinocytose in vitro og in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. Makropinosomer kan skille seg fra andre endokytiske veier gjennom deres evne til å internalisere store makromolekyler, som høymolekylær dextran (dvs. 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Dermed kan makropinosomer defineres gjennom opptak av ekstracellulært administrert fluorofor-merket 70 kDa dextran. Som et resultat manifesterer makropinocytiske vesikler som intracellulære klynger av fluorescerende puncta med størrelser fra 0,2-5 μm. Disse puncta kan mikroskopisk avbildes og deretter kvantifiseres for å bestemme omfanget av makropinocytose i cellen – ‘den makropinocytiske indeksen’.

I denne protokollen er de viktigste trinnene for å visualisere makropinosomer i adherentceller in vitro på en 96-brønns mikroplate og deksler ved hjelp av standard laboratorieutstyr beskrevet (figur 1). I tillegg er instruksjonene for å automatisere bildeanskaffelsen og kvantifiseringen av den makropinocytiske indeksen ved hjelp av en celleavbildningsplateleser i flere moduser gitt. Denne automatiseringen reduserer tid, kostnader og krefter sammenlignet med våre tidligere beskrevne ^{protokoller19,20}. I tillegg unngår den utilsiktet partisk bildeinnsamling og analyse og forbedrer dermed reproduserbarhet og pålitelighet. Denne metoden kan enkelt tilpasses ulike celletyper eller platelesere eller brukes til å bestemme alternative makropinosomfunksjoner, for eksempel størrelse, antall og plassering. Den heri beskrevne metoden er spesielt egnet for screening av cellekulturforhold som induserer makropinocytose, identifisering av nye modulatorer eller optimalisering av legemiddelkonsentrasjoner av kjente inhibitorer.

Figur 1: Skjematisk for den automatiserte analysen for å bestemme den ‘makropinocytiske indeksen’ i tilhengerceller. Opprettet ved hjelp av BioRender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Fremstilling av materialer Løs opp 70 kDa dextran merket med FITC eller tetrametylrhodamin (TMR) i PBS for å få en 20 mg/ml oppløsning. Oppbevar aliquots ved -20 °C. Løs opp DAPI i ddH2O for å få en 1 mg/ml oppløsning. Oppbevar aliquots ved -20 °C.FORSIKTIG: DAPI er et potensielt kreftfremkallende middel og bør håndteres med forsiktighet. På fikseringsdagen, lag fersk 3,7% ACS-klasse formaldehyd i PBS.FORSIKTIG: Formaldehyd er et fikseringsmiddel, kjent kre…

Representative Results

Når trinnene og justeringen av den ovenfor beskrevne protokollen følges tilsvarende, bør de endelige eksperimentelle resultatene gi informasjon om de studerte cellekulturforholdene eller inhibitorene induserer eller reduserer makropinocytose i cellelinjen av interesse. For å styrke gyldigheten av disse funnene, vil inkludering av kontrollforhold tillate gransking av resultatene for å avgjøre om eksperimentet er fullført. Makropinocytoseinduksjonskontroller vil gi informasjon om det relative nivået av makropinocyt…

Discussion

Kvaliteten på forsøkene og datainnsamlingen avhenger sterkt av kvaliteten på reagensene, optimaliseringen av innstillingene og rensligheten av dekslene og mikroplaten. De endelige resultatene skal gi minimal variasjon mellom replikeringer; Biologiske variasjoner forekommer imidlertid naturlig eller kan på annen måte være forårsaket av en rekke faktorer. Celletetthet kan føre til at celler reagerer mer eller mindre på makropinocytoseindusere eller hemmere. Det er derfor avgjørende å følge 80% samløp som fores…

Materials

0.25% Trypsin	Corning	25053CI	0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisherbrand	05-408-129
10-cm Tissue culture dish	Greiner Bio-One	664160	CELLSTAR
15 mL Centrifuge tube	Fisherbrand	07-200-886
2 L Beaker	Fisherbrand	02-591-33
24-well Tissue culture plate	Greiner Bio-One	662160	CELLSTAR
25 mL Reagent reservoir	Genesee Scientific Corporation	28-121
500 mL Beaker	Fisherbrand	02-591-30
6-cm Tissue culture dish	Greiner Bio-One	628160	CELLSTAR
8-Channel aspiration adapter	Integra Biosciences	155503
8-Channel aspiration adapter for standard tips	Integra Biosciences	159024
95% Ethanol	Decon Laboratories Inc	4355226
Ammonia-free glass cleaner	Sparkle	FUN20500CT
Black 96-well high-content screening microplate	PerkinElmer	6055300	CellCarrier-96 Ultra
Cotton-tipped applicator	Fisherbrand	23-400-101
Coverslips	Fisherbrand	12-545-80	12 mm diameter
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Biotek	CYT5FW
DAPI	Millipore Sigma	5.08741
Dextran 70 kDa – FITC	Life Technologies	D1822	Lysine-fixable
Dextran 70 kDa – TMR	Life Technologies	D1819
DMSO	Millipore Sigma	D1435
DPBS	Corning	21031CV	Without Calcium and Magnesium
Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
Formaldehyde, 37%	Ricca Chemical	RSOF0010-250A	ACS Reagent Grade
Glycerol	Fisher BioReagents	BP229-1
Hardening fluorescence mounting media	Agilent Tech	S302380-2	DAKO
Hoechst 33342	Millipore Sigma	B2261
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	Certified ACS Plus, 36.5%–38.0%
Lint-free wipes	Kimberly-Clark	34155	Kimwipes
Miscroscope slides	Fisherbrand	12-544-1	Premium plain glass
Multichannel pipette	Gilson	FA10013	8 channels, 0.5–10 µL
Multichannel pipette	Gilson	FA10012	12 channels, 20–200 µL
Multichannel pipette	Gilson	FA10011	8 channels, 20–200 µL
Parafilm M	Pechiney	PM996
Plastic wrap	Kirkland Signature	208733	Stretch-Tite
Silicone isolators	Grace Bio Labs Inc	664107	13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm
Slide adapter	Biotek	1220548
Wash bottle	Fisherbrand	FB0340922C