Automatiserad avbildning och analys för kvantifiering av fluorescerande märkta makropinosomer

Summary

Automatiserade analyser med hjälp av mikroplattor med flera brunnar är fördelaktiga metoder för att identifiera vägregulatorer genom att möjliggöra bedömning av en mängd villkor i ett enda experiment. Här har vi anpassat det väletablerade makropinosombilds- och kvantifieringsprotokollet till ett 96-väl mikroplattaformat och ger en omfattande disposition för automatisering med hjälp av en flerlägesplattaläsare.

Abstract

Makropinocytos är en icke-specifik vätskefas upploppsväg som gör det möjligt för celler att internalisera stor extracellulär last, såsom proteiner, patogener och cellskräp, genom bulk endocytos. Denna väg spelar en viktig roll i en mängd cellulära processer, inklusive reglering av immunsvar och cancercellsmetabolism. Med tanke på denna betydelse i biologisk funktion kan undersökning av cellodlingsförhållanden ge värdefull information genom att identifiera tillsynsmyndigheter för denna väg och optimera villkor som ska användas vid upptäckten av nya terapeutiska metoder. Studien beskriver en automatiserad bild- och analysteknik med hjälp av standard laboratorieutrustning och en cellavbildningsplatta för snabb kvantifiering av makropinocytiskt index i vidhäftande celler. Den automatiserade metoden är baserad på upptag av fluorescerande dextran med hög molekylvikt och kan appliceras på 96-brunnsmikroplattor för att underlätta bedömningar av flera förhållanden i ett experiment eller fasta prover monterade på glasöverdrag. Detta tillvägagångssätt syftar till att maximera reproducerbarheten och minska experimentell variation samtidigt som den är både tidsbesparande och kostnadseffektiv.

Introduction

Den icke-specifika endocytiska vägen för makropinocytos gör det möjligt för celler att internalisera en mängd extracellulära komponenter, inklusive näringsämnen, proteiner, antigener och patogener, genom bulkupptag av extracellulär vätska och dess ^{beståndsdelar1}. Även om det är viktigt för biologin hos många celltyper, beskrivs makropinocytosvägen i allt högre grad spela en viktig roll i tumörbiologi, där tumörceller genom makropinocytisk upptaktning kan överleva och föröka sig i närvaro av en näringsfattig ^{mikromiljö2,3}. Upptaget av extracellulära makromolekyler, inklusive albumin och extracellulär matris, och nekrotiska cellrester, ger en alternativ näringskälla för biomassaproduktion genom att skapa aminosyror, sockerarter, lipider och nukleotider genom makropinosom och lysosom fusionsmedierad lastkatabolism4,5,6,7,8.

Induktion och reglering av makropinocytos är komplexa och kan variera beroende på cellulära sammanhang. Hittills har flera inducerare av makropinocytos identifierats och inkluderar ligands, såsom epidermal tillväxtfaktor (EGF), trombocyt-härledda tillväxtfaktor (PDGF), galectin-3 och Wnt3A9,10,11,12,13. Dessutom kan odlingsförhållanden som efterliknar tumörmikromiljön utlösa aktivering av vägen. Bukspottskörteln duktal adenocarcinom (PDAC) tumörer är näringsfattiga, särskilt för aminosyran glutamin, vilket gör att både cancerceller och cancerassocierade fibroblaster (CAFs) förlitar sig på makropinocytos för överlevnad7,13,14,15. Dessutom kan tumörspänningar, såsom hypoxi och oxidativ stress, aktivera denna rensningsväg16. Förutom de många extrinsic påverkare som kan inducera macropinocytosis, en mängd intracellulära vägar kontrollera makropinosom bildas. Onkogen Rasmedierad transformation är tillräcklig för att initiera makropinocytiska maskineri, och flera cancertyper uppvisar onkogen Ras-driven konstituerande makropinocytos4,5,9,17. Alternativt har rasaktivering av vildtyp och Ras-oberoende vägar identifierats för att aktivera makropinocytos i cancerceller och CAFs10,11,15,18. Användningen av olika in vitro-modeller i kombination med inhibitorbehandlingar har resulterat i identifiering av flera makropinocytosmodulatorer, som inkluderar natrium-väteväxlare, den lilla GTPase Rac1, fosphoinositide 3-kinas (PI3K), p21-aktiverad kinas (Pak) och AMP-aktiverad proteinkinas (AMPK)^4,13,15 . Med tanke på den mängd beskrivna faktorer och villkor som reglerar makropinocytos är det dock tänkbart att många fler modulatorer och stimuli förblir oupptäckta. Identifieringen av nya modulatorer och stimuli kan underlättas genom automatiserad bedömning av en mängd villkor i ett enda experiment. Denna metodik kan kasta ljus över de faktorer som är involverade i makropinosombildning och kan möjliggöra upptäckten av nya små molekyler eller biologiska läkemedel som riktar sig till denna väg.

Här har vi anpassat vårt tidigare etablerade protokoll för att bestämma omfattningen av makropinocytos i cancerceller in vitro till ett 96-brunns mikroplate format och automatiserad avbildning och ^{kvantifiering19,20}. Detta protokoll är baserat på fluorescerande mikroskopi, som har blivit en standard inom området för att bestämma makropinocytos in vitro och in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18^, 19,20,21,22. Makropinosomer kan särskiljas från andra endocytiska vägar genom sin förmåga att internalisera stora makromolekyler, såsom hög molekylvikt dextran (dvs. 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Makropinosomer kan således definieras genom upptaget av extracellulärt administrerade fluorofor-märkta 70 kDa dextran. Som ett resultat manifesterar makropinocytiska blåsor som intracellulära kluster av fluorescerande punkter med storlekar från 0,2-5 μm. Dessa punkter kan avbildas mikroskopiskt och därefter kvantifieras för att bestämma omfattningen av makropinocytos i cellen – “det makropinocytiska indexet”.

I detta protokoll beskrivs de viktigaste stegen för att visualisera makropinosomer i vidhäftande celler in vitro på en 96-väl mikroplatta och täckslipar med hjälp av standard laboratorieutrustning (figur 1). Dessutom tillhandahålls anvisningarna för att automatisera bildförvärvet och kvantifieringen av makropinocytiskt index med hjälp av en cellavbildningsplatta med flera lägen. Denna automatisering minskar tid, kostnad och ansträngning jämfört med våra tidigare beskrivna ^{protokoll19,20}. Dessutom undviker det oavsiktligt partisk bildförvärv och analys och förbättrar därmed reproducerbarhet och tillförlitlighet. Den här metoden kan enkelt anpassas till olika celltyper eller plattläsare eller användas för att bestämma alternativa makropinosomfunktioner, till exempel storlek, antal och plats. Den här beskrivs metoden är särskilt lämplig för screening av cellodling villkor som inducerar makropinocytos, identifiering av nya modulatorer eller optimering av läkemedelskoncentrationer av kända hämmare.

Figur 1: Schematisk av den automatiserade analysen för att bestämma det “makropinocytiska indexet” i vidhäftande celler. Skapad med BioRender. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Protocol

1. Beredning av material Lös upp 70 kDa dextran märkt med FITC eller tetrametylrhodamin (TMR) i PBS för att erhålla en 20 mg/ml-lösning. Förvara alikvoterna vid -20 °C. Lös dapi i ddH2O för att erhålla en 1 mg/ml-lösning. Förvara alikvoterna vid -20 °C.VARNING: DAPI är ett potentiellt cancerframkallande ämne och bör hanteras varsamt. På fixeringsdagen, förbered färsk 3,7% ACS-formaldehyd i PBS.VARNING: Formaldehyd är ett fixativt, känt cancerframkallan…

Representative Results

När stegen och justeringen av ovannämnda protokoll följs i enlighet därmed, bör de slutliga experimentella resultaten ge information om huruvida de studerade cellodlingsförhållandena eller hämmarna inducerar eller minskar makropinocytos i den cellinje som är av intresse. För att stärka giltigheten av dessa resultat kommer införandet av kontrollvillkor att möjliggöra granskning av resultaten för att avgöra om experimentet har slutförts framgångsrikt. Makropinocytosis induktionskontroller kommer att ge in…

Discussion

Kvaliteten på experimenten och datainsamlingen beror i hög grad på reagensernas kvalitet, optimeringen av inställningarna och renheten hos täcksliparna och mikroplattan. De slutliga resultaten bör ge minimal variation mellan replikat. Biologiska variationer förekommer dock naturligt eller kan på annat sätt orsakas av ett antal faktorer. Celldensitet kan orsaka att celler reagerar mer eller mindre på makropinocytosinducerare eller hämmare. Det är därför mycket viktigt att hålla fast vid det 80-procentiga sa…

Materials

0.25% Trypsin	Corning	25053CI	0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisherbrand	05-408-129
10-cm Tissue culture dish	Greiner Bio-One	664160	CELLSTAR
15 mL Centrifuge tube	Fisherbrand	07-200-886
2 L Beaker	Fisherbrand	02-591-33
24-well Tissue culture plate	Greiner Bio-One	662160	CELLSTAR
25 mL Reagent reservoir	Genesee Scientific Corporation	28-121
500 mL Beaker	Fisherbrand	02-591-30
6-cm Tissue culture dish	Greiner Bio-One	628160	CELLSTAR
8-Channel aspiration adapter	Integra Biosciences	155503
8-Channel aspiration adapter for standard tips	Integra Biosciences	159024
95% Ethanol	Decon Laboratories Inc	4355226
Ammonia-free glass cleaner	Sparkle	FUN20500CT
Black 96-well high-content screening microplate	PerkinElmer	6055300	CellCarrier-96 Ultra
Cotton-tipped applicator	Fisherbrand	23-400-101
Coverslips	Fisherbrand	12-545-80	12 mm diameter
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Biotek	CYT5FW
DAPI	Millipore Sigma	5.08741
Dextran 70 kDa – FITC	Life Technologies	D1822	Lysine-fixable
Dextran 70 kDa – TMR	Life Technologies	D1819
DMSO	Millipore Sigma	D1435
DPBS	Corning	21031CV	Without Calcium and Magnesium
Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
Formaldehyde, 37%	Ricca Chemical	RSOF0010-250A	ACS Reagent Grade
Glycerol	Fisher BioReagents	BP229-1
Hardening fluorescence mounting media	Agilent Tech	S302380-2	DAKO
Hoechst 33342	Millipore Sigma	B2261
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	Certified ACS Plus, 36.5%–38.0%
Lint-free wipes	Kimberly-Clark	34155	Kimwipes
Miscroscope slides	Fisherbrand	12-544-1	Premium plain glass
Multichannel pipette	Gilson	FA10013	8 channels, 0.5–10 µL
Multichannel pipette	Gilson	FA10012	12 channels, 20–200 µL
Multichannel pipette	Gilson	FA10011	8 channels, 20–200 µL
Parafilm M	Pechiney	PM996
Plastic wrap	Kirkland Signature	208733	Stretch-Tite
Silicone isolators	Grace Bio Labs Inc	664107	13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm
Slide adapter	Biotek	1220548
Wash bottle	Fisherbrand	FB0340922C