تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae
Summary
على الرغم من التقدم الأخير، العديد من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة لا تزال مع وظائفها غير معروف تماما. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموثوقة لتحديد توطين البروتينات في الخلايا الراسية، والتي كانت أساسية لتوضيح وظائفها الجزيئية.
Abstract
على الرغم من التقدم الأخير في توصيف بروتيوم الميتوكوندريا الخميرة، وتوطين submitochondrial لعدد كبير من البروتينات لا يزال بعيد المنال. هنا، ونحن نصف طريقة قوية وفعالة لتحديد توطين suborganellar من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة، والتي تعتبر خطوة أساسية خلال توضيح وظيفة البروتين الميتوكوندريا. هذه الطريقة تنطوي على خطوة الأولية التي تتكون من الحصول على الميتوكوندريا سليمة نقية للغاية. ثم تخضع هذه الاستعدادات الميتوكوندريا لبروتوكول الانكسار الذي يتكون من صدمة نقصوتونية (تورم) والحضانة مع البروتين K (بروتياز). أثناء التورم ، يتم تعطيل غشاء الميتوكوندريا الخارجي بشكل انتقائي ، مما يسمح للبروتيناز K بهضم بروتينات مقصورة الفضاء بين الميمبران. في موازاة ذلك، للحصول على معلومات حول طوبولوجيا بروتينات الأغشية، يتم في البداية سونيكاتيد الاستعدادات الميتوكوندريا، ومن ثم تتعرض لاستخراج القلوية مع كربونات الصوديوم. وأخيرا ، بعد الطرد المركزي ، يتم تحليل الكسور الحبيبية والناسخة من هذه العلاجات المختلفة من قبل SDS-PAGE ولطخة غربية. يتم الحصول على توطين submitochondrial وكذلك طوبولوجيا الغشاء من البروتين من الفائدة من خلال مقارنة ملفها الشخصي وصمة عار الغربية مع المعايير المعروفة.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية للخلايا eukaryotic التي تلعب أدوارا حاسمة في الجيوجيستيك الحيوية، والتمثيل الغذائي الخلوي، ومسارات الإشارات1. لتنفيذ هذه المهام بشكل صحيح، تعتمد الميتوكوندريا على مجموعة فريدة من البروتينات والدهون المسؤولة عن بنيتها ووظيفتها. وقد استخدمت الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae على نطاق واسع كنظام نموذجي للتحقيقات في عمليات الميتوكوندريا، وكذلك ل organelles2 أخرى. رموز الجينوم الميتوكوندريا لثمانية بروتينات فقط في الخميرة. يتم ترميز الغالبية العظمى من بروتينات الميتوكوندريا (~99٪) بواسطة الجينات النووية، والتي تترجم على الريبوسومات السيتوسولية، ويتم استيرادها بعد ذلك إلى مقصوراتها ال submitochondrial الصحيحة بواسطة آلات استيراد البروتين المتطورة3،4،5. وهكذا، يعتمد التكوين الحيوي الميتوكوندريا على التعبير المنسق لكل من الجينوم النووي والميتوكوندريا6,7. ترتبط الطفرات الوراثية المسببة لعيوب في التكوين الحيوي الميتوكوندريا بالأمراض البشرية8,9,10.
في العقدين الماضيين، أسفرت الدراسات البروتيومية عالية الإنتاجية التي تستهدف الميتوكوندريا عالية النقاء عن توصيف شامل للبروتيوم الميتوكوندريا الخميرة، والتي قدرت أن تتكون من ما لا يقل عن 900 البروتينات11،12،13،14. على الرغم من أن هذه الدراسات قدمت معلومات قيمة، فإن توطين شبه العضوية لكل بروتين في الأقسام الفرعية الأربعة للميتوكوندريا، وهي الغشاء الخارجي (OM)، والفضاء بين الميمبران (IMS)، والغشاء الداخلي (IM)، والمصفوفة، لا يزال مطلوبا. وقد عولجت هذه المسألة جزئيا مع دراسات على نطاق بروتيوميك من اثنين من أصغر الإدارات الفرعية الميتوكوندريا (OM وIMS)15,16. وفي الآونة الأخيرة، خطت شركة Vögtle والمتعاونون معها خطوة كبيرة إلى الأمام من خلال إنشاء خريطة عالمية عالية الجودة لتوزيع البروتين البروبوسوندري في الخميرة. باستخدام نهج متكامل يجمع بين قياس الطيف الكتلي الكمي القائم على SILAC ، وبروتوكولات الكسر الإرسالي المختلفة ، ومجموعة البيانات من OM وIMS proteomes ، خصص المؤلفون 818 بروتينا في الأقسام الفرعية الأربعة للميتوكوندريا13.
على الرغم من التقدم الذي حققته هذه الدراسات البروتيومية عالية الإنتاجية ، فإن معرفتنا حول تكوين البروتيوم البروتيومي البروتيدري أبعد ما تكون عن الاكتمال. في الواقع، من بين 986 البروتينات التي ذكرت من قبل Vögtle والمتعاونين بأنها مترجمة في الميتوكوندريا الخميرة، لا يمكن تعيين 168 في أي من المقصورات submitochondrial الأربعة13. وعلاوة على ذلك، لم يقدم المؤلفون معلومات حول طوبولوجيا الأغشية من البروتينات التي كان من المتوقع أن تكون مرتبطة هامشيا إلى محيط الأغشية الميتوكوندريا. على سبيل المثال، لا يمكن معرفة ما إذا كان البروتين الذي تم تعيينه كبروتين متصل بشكل هامشي بالغشاء الداخلي يواجه المصفوفة أو الفضاء بين الغشاء. وبصرف النظر عن هذه البيانات المفقودة من الدراسات على نطاق البروتيوم، هناك معلومات متضاربة حول توطين شبه العضوية لعدد كبير من بروتينات الميتوكوندريا. ومن الأمثلة على ذلك البروتياز Prd1، الذي تم تعيينه كبروتين فضائي بين الميمبران في قواعد البيانات المشتركة مثل قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces (SGD) وUniprot. من المستغرب ، وذلك باستخدام بروتوكول الانكسار مماثلة لتلك الموصوفة هنا ، Vögtle والمتعاونين أظهرت بوضوح أن Prd1 هو بروتين مصفوفة حقيقية13. كما ذكر أعلاه، يجب توضيح توطين العديد من بروتينات الميتوكوندريا أو إعادة تقييمه. هنا، ونحن نقدم بروتوكول بسيط وموثوق بها لتحديد توطين suborganellar من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة. تم تطوير هذا البروتوكول وتحسينه من قبل مجموعات بحثية مختلفة وتم استخدامه بشكل روتيني لتحديد توطين ال submitochondrial ، وكذلك طوبولوجيا الغشاء للعديد من بروتينات الميتوكوندريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم استخدام البروتوكول المعروض هنا بنجاح وتحسينه باستمرار لفترة طويلة لتحديد توطين البروتين في مقصورات الخضوع للشهية13,14,18,21,22,23. تعتمد موثوقية هذا البروتوكول وقابليته لإعادة ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور أ. تزاغولوف (جامعة كولومبيا) على توفير الأجسام المضادة التي أثيرت ضد بروتينات علامة submitochondrial Cyt. b2، αKGD، وسكو1. ونشكر أيضا الدكتور ماريو هنريك دي باروس (جامعة ساو باولو) على المناقشات والتعليقات المفيدة أثناء وضع هذا البروتوكول.
وقد دعم هذا العمل منح بحثية من مؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado de São Paulo (منحة 2013/07937-8).
فرناندو غوميز وهيلينا تورانو مدعومان أيضا من قبل FAPESP، المنح 2017/09443-3 و 2017/23839-7 على التوالي. كما تحظى أنجيليكا راموس بدعم من كورديناساو دي أبيرفيسوامنتو دي بيسوال دي نيفل سوبيريور (CAPES).
Materials
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
- Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
- Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
- Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
- Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
- Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
- Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
- Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
- Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
- Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).
- Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
- Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
- Vögtle, F. -. N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
- Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
- Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
- Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
- Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
- Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).
- Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
- Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
- Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
- Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
- Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).
