Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Summary

Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.

Abstract

Ondanks recente vooruitgang in de karakterisering van gist mitochondriaal proteoom, blijft de submitochondrial lokalisatie van een aanzienlijk aantal eiwitten ongrijpbaar. Hier beschrijven we een robuuste en effectieve methode voor het bepalen van de suborganellaire lokalisatie van gist mitochondriale eiwitten, die wordt beschouwd als een fundamentele stap tijdens mitochondriale eiwitfunctie-opheldering. Deze methode omvat een eerste stap die bestaat uit het verkrijgen van zeer zuivere intacte mitochondriën. Deze mitochondriale preparaten worden vervolgens onderworpen aan een subfractionatieprotocol bestaande uit hypotone shock (zwelling) en incubatie met proteïnase K (protease). Tijdens zwelling wordt het buitenste mitochondriale membraan selectief verstoord, waardoor het proteïnase K eiwitten van het intermembraanruimtecompartiment kan verteren. Tegelijkertijd, om informatie te verkrijgen over de topologie van membraaneiwitten, worden de mitochondriale preparaten in eerste instantie gesoniseerd en vervolgens onderworpen aan alkalische extractie met natriumcarbonaat. Ten slotte worden na centrifugeren de pellet- en supernatantfracties van deze verschillende behandelingen geanalyseerd door SDS-PAGE en western blot. De submitchondriale lokalisatie en de membraantopologie van het eiwit van belang wordt verkregen door het western blot-profiel te vergelijken met bekende standaarden.

Introduction

Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryote cellen die een cruciale rol spelen in bio-energetica, cellulair metabolisme en ^{signaalroutes1}. Om deze taken goed uit te voeren, vertrouwen mitochondriën op een unieke set eiwitten en lipiden die verantwoordelijk zijn voor hun structuur en functie. De ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae is veel gebruikt als modelsysteem voor onderzoek naar mitochondriale processen, evenals voor andere ^organellen2. Het mitochondriale genoom codeert voor slechts acht eiwitten in gist; de overgrote meerderheid van mitochondriale eiwitten (~99%) wordt gecodeerd door nucleaire genen, die worden vertaald op cytosolische ribosomen, en vervolgens geïmporteerd in hun juiste submitochondriale compartimenten door geavanceerde eiwitimportmachines3,4,5. Mitochondriale biogenese hangt dus af van de gecoördineerde expressie van zowel het nucleaire als het mitochondriale ^genoom6,7. Genetische mutaties die defecten in mitochondriale biogenese veroorzaken, zijn geassocieerd met ziekten bij de mens8,9,10.

In de afgelopen twee decennia resulteerden proteomische studies met hoge doorvoer gericht op sterk gezuiverde mitochondriën in een uitgebreide karakterisering van gist mitochondriaal proteoom, dat naar schatting bestaat uit ten minste 900 eiwitten11,12,13,14. Hoewel deze studies waardevolle informatie opleverden, is de suborganellaire lokalisatie van elk eiwit in de vier mitochondriale subsecties, namelijk het buitenmembraan (OM), de intermembraanruimte (IMS), het binnenmembraan (IM) en de matrix, nog steeds vereist. Deze vraag werd gedeeltelijk beantwoord met proteomische studies van de twee kleinere mitochondriale subcompartementen (OM en IMS)^15,16. Meer recent hebben Vögtle en medewerkers een grote stap voorwaarts gezet door een hoogwaardige wereldwijde kaart van de distributie van submitochondriale eiwitten in gist te genereren. Met behulp van een geïntegreerde aanpak die SILAC-gebaseerde kwantitatieve massaspectrometrie, verschillende submitchondriële fractioneringsprotocollen en de dataset van de OM- en IMS-proteomen combineert, hebben de auteurs 818 eiwitten toegewezen aan de vier mitochondriale subcompartmenten13.

Ondanks de vooruitgang die deze high-throughput proteomische studies hebben geboekt, is onze kennis over de samenstelling van het submitochondriale proteoom verre van compleet. Inderdaad, van de 986 eiwitten die door Vögtle en medewerkers werden gerapporteerd als gelokaliseerd in gist mitochondriën, konden er 168 niet worden toegewezen in een van de vier submitchondriële ^{compartimenten13}. Bovendien gaven de auteurs geen informatie over de membraantopologie van eiwitten waarvan werd voorspeld dat ze perifeer aan de periferie van mitochondriale membranen waren bevestigd. Het is bijvoorbeeld niet mogelijk om te weten of een eiwit dat is toegewezen als perifeer bevestigd aan het binnenmembraan zich naar de matrix of de intermembraanruimte bevindt. Afgezien van deze ontbrekende gegevens uit de proteoombrede studies, is er tegenstrijdige informatie over de suborganellaire lokalisatie van een aanzienlijk aantal mitochondriale eiwitten. Een voorbeeld is het protease Prd1, dat is toegewezen als een intermembraan ruimte-eiwit in de gemeenschappelijke databases zoals Saccharomyces Genome Database (SGD) en Uniprot. Verrassend genoeg toonden Vögtle en medewerkers met behulp van een subfractionatieprotocol vergelijkbaar met het hier beschreven protocol duidelijk aan dat Prd1 een echt ^{matrixeiwit13} is. Zoals hierboven vermeld, moet de submitchondrial lokalisatie van veel mitochondriale eiwitten worden opgehelderd of opnieuw geëvalueerd. Hier bieden we een eenvoudig en betrouwbaar protocol om de suborganellaire lokalisatie van gist mitochondriale eiwitten te bepalen. Dit protocol is ontwikkeld en geoptimaliseerd door verschillende onderzoeksgroepen en is routinematig gebruikt om de submitchondrial lokalisatie te bepalen, evenals de membraantopologie van veel mitochondriale eiwitten.

Protocol

1. Groei van gistcellen Isoleer enkele kolonies van de stam van belang door een klein deel van de cellen van een -80 °C glycerolvoorraad op een YPD (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose) agarplaat te strepen. Incubeer de plaat bij 30 °C gedurende 2-3 dagen.OPMERKING: De S. cerevisiae-stam die in dit protocol wordt gebruikt, is afgeleid van BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Met uitzondering van de …

Representative Results

Het succes van het submitchondrial fractioneringsprotocol hangt af van het verkrijgen van sterk gezuiverde intacte mitochondriën. Hiervoor is het essentieel dat tijdens de gistcellysis de intactheid van de organellen bijna volledig bewaard blijft. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een cellysisprotocol dat de enzymatische vertering van de celwand combineert, gevolgd door fysieke verstoring van het plasmamembraan door een Dounce-homogenisator te gebruiken. De mitochondriale inhoud wordt vervolgens verzameld door…

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol is met succes gebruikt en continu geoptimaliseerd voor een lange tijd om de eiwitlokalisatie in de submitochondrial compartimenten13,14,18,21,22,23 te bepalen. De betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van dit protocol zijn sterk afhankelijk van de zuiverheid en integriteit van mitochondriale …

Materials

Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast extract	BD	212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A7030	Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815	Component of DDT buffer
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Galactose	Sigma-Aldrich	G0625
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Proteinase K	Sigma-Aldrich
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma-Aldrich	T6399
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus	MP Biomedicals, Irvine, CA	320921	Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast