Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi
Summary
Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.
Abstract
Maya mitokondriyal proteomunun karakterizasyonundaki son gelişmelere rağmen, önemli sayıda proteinin boyunkondriyal lokalizasyonu zor olmaya devam etmektedir. Burada, mitokondriyal protein fonksiyonu elucidation sırasında temel bir adım olarak kabul edilen maya mitokondriyal proteinlerin suborganeller lokalizasyonunu belirlemek için sağlam ve etkili bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, son derece saf bozulmamış mitokondri elde etmekten oluşan bir ilk adımı içerir. Bu mitokondriyal preparatlar daha sonra hipotonik şok (şişlik) ve proteinaz K (proteaz) ile inkübasyondan oluşan bir subfraksiyon protokolüne tabi tutulur. Şişlik sırasında, dış mitokondriyal membran seçici olarak bozulur ve proteinaz K’nin intermembran uzay bölmesinin proteinlerini sindirmesine izin verir. Buna paralel olarak, membran proteinlerinin topolojisi hakkında bilgi edinmek için, mitokondriyal preparatlar başlangıçta sonikasyona tabi tutulur ve daha sonra sodyum karbonat ile alkali ekstraksiyona tabi tutulur. Son olarak, santrifüjlemeden sonra, bu farklı tedavilerden elde edilen pelet ve süpernatant fraksiyonları SDS-PAGE ve batı lekesi tarafından analiz edilir. Submitochondrial lokalizasyon ve ilgi proteininin membran topolojisi, batı leke profili bilinen standartlarla karşılaştırılarak elde edilir.
Introduction
Mitokondriler, biyoenergetik, hücresel metabolizma ve sinyal yollarında önemli roller oynayan ökaryotik hücrelerin temel organelleridir1. Bu görevleri düzgün bir şekilde yürütmek için mitokondri, yapılarından ve işlevlerinden sorumlu benzersiz bir protein ve lipit kümesine güvenir. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae, mitokondriyal süreçler üzerindeki araştırmalar ve diğer organeller için bir model sistemi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır2. Mayadaki sadece sekiz protein için mitokondriyal genom kodları; mitokondriyal proteinlerin büyük çoğunluğu (~%99), sitosolik ribozomlar üzerine çevrilen nükleer genler tarafından kodlanır ve daha sonra sofistike protein ithalat makineleri tarafından doğru boyunkopondriyal bölmelerine ithal edilir3,4,5. Bu nedenle, mitokondriyal biyogenez hem nükleer hem de mitokondriyal genomların koordineli ifadesine bağlıdır6,7. Mitokondriyal biyogenezde kusurlara neden olan genetik mutasyonlar insan hastalıkları ile ilişkilidir8,9,10.
Son yirmi yılda, yüksek saflaştırılmış mitokondrileri hedefleyen yüksek verimli proteomik çalışmalar, en az 900 proteinden oluştuğu tahmin edilen maya mitokondriyal proteomunun kapsamlı bir şekilde nitelendirilmesiyle sonuçlandı11,12,13,14. Bu çalışmalar değerli bilgiler sağlasa da, dört mitokondriyal alt şirketteki her proteinin, yani dış zarın (OM), intermembran alanının (IMS), iç zarın (IM) ve matrisin suborganeller lokalizasyonu hala gereklidir. Bu soru, iki küçük mitokondriyal alt bileşenin (OM ve IMS)15,16’nın proteomik geniş çalışmaları ile kısmen ele alındı. Daha yakın zamanda, Vögtle ve işbirlikçileri mayada yüksek kaliteli bir küresel sekonondriyal protein dağılımı haritası oluşturarak ileriye doğru büyük bir adım attı. SILAC tabanlı nicel kütle spektrometresi, farklı boyunkondriyal fraksiyon protokolleri ve OM ve IMS proteomlarından elde edilen verileri birleştiren entegre bir yaklaşım kullanan yazarlar, dört mitokondriyal alt bölüme 818 protein atadı13.
Bu yüksek verimli proteomik çalışmaların elde ettiği gelişmelere rağmen, submitochondrial proteome bileşimi hakkındaki bilgimiz tamamlanmaktan çok uzaktır. Gerçekten de, Vögtle ve işbirlikçileri tarafından maya mitokondrilerine lokalize olduğu bildirilen 986 protein arasında, dört boyunluk bölmeden hiçbirine 168 atanamadı13. Ayrıca, yazarlar mitokondriyal membranların çevresine periferik olarak bağlı olduğu tahmin edilen proteinlerin membran topolojisi hakkında bilgi vermediler. Örneğin, iç zara periferik olarak atanan bir proteinin matrise mi yoksa intermembran uzaya mı dönük olduğunu bilmek mümkün değildir. Proteome çapındaki çalışmalardan elde edilen bu eksik verilerin yanı sıra, önemli sayıda mitokondriyal proteinin suborganeller lokalizasyonu hakkında çelişkili bilgiler vardır. Saccharomyces Genom Veritabanı (SGD) ve Uniprot gibi ortak veritabanlarında intermembran uzay proteini olarak atanan proteaz Prd1 buna bir örnektir. Şaşırtıcı bir şekilde, burada açıklanana benzer bir alt ihlal protokolü kullanarak, Vögtle ve işbirlikçileri Prd1’in gerçek bir matris proteini olduğunu açıkça gösterdi13. Yukarıda belirtildiği gibi, birçok mitokondriyal proteinin submitochondrial lokalizasyonunun aydınlatılması veya yeniden değerlendirilmesi gerekir. Burada, maya mitokondriyal proteinlerin suborganeller lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir protokol sunuyoruz. Bu protokol çeşitli araştırma grupları tarafından geliştirilmiş ve optimize edilmiştir ve birçok mitokondriyal proteinin membran topolojisinin yanı sıra boyunkondriyal lokalizasyonu belirlemek için rutin olarak kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol, submitochondrial bölmelerdeki protein lokalizasyonunu belirlemek için uzun süredir başarıyla kullanılmış ve sürekli olarak optimize edilmiştir13,14,18,21,22,23. Bu protokolün güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği, mitokondriyal preparatların saflığına ve bütünlüğüne güçlü bir …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. A. Tzagoloff’a (Columbia Üniversitesi) boyunokondriyal belirteç proteinleri Cyt’e karşı yetiştirilen antikorları sağladığı için teşekkür ederiz. b2, αKGD ve Sco1. Ayrıca, bu protokolün oluşturulması sırasında yararlı tartışmalar ve yorumlar için Dr. Mario Henrique de Barros’a (Universidade de São Paulo) teşekkür ederiz.
Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) araştırma hibeleri ile desteklendi (grant 2013/07937-8).
Fernando Gomes ve Helena Turano da SıRASıYLA 2017/09443-3 ve 2017/23839-7 hibeleri olan FAPESP tarafından desteklenmektedir. Angélica Ramos ayrıca Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
- Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
- Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
- Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
- Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
- Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
- Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
- Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
- Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
- Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).
- Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
- Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
- Vögtle, F. -. N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
- Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
- Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
- Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
- Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
- Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).
- Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
- Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
- Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
- Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
- Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).
