Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae
Summary
A pesar de los avances recientes, muchas proteínas mitocondriales de levadura aún permanecen con sus funciones completamente desconocidas. Este protocolo proporciona un método sencillo y fiable para determinar la localización submitocondrial de proteínas, que ha sido fundamental para la elucidación de sus funciones moleculares.
Abstract
A pesar de los recientes avances en la caracterización del proteoma mitocondrial de levadura, la localización submitocondrial de un número significativo de proteínas sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí, describimos un método robusto y efectivo para determinar la localización suborganeular de las proteínas mitocondriales de levadura, que se considera un paso fundamental durante la elucidación de la función de la proteína mitocondrial. Este método implica un paso inicial que consiste en obtener mitocondrias intactas altamente puras. Estas preparaciones mitocondriales se someten a un protocolo de subacccionamiento que consiste en shock hipotónico (hinchazón) e incubación con proteinasa K (proteasa). Durante la hinchazón, la membrana mitocondrial externa se interrumpe selectivamente, lo que permite que la proteinasa K digiera las proteínas del compartimento espacial intermembrana. Paralelamente, para obtener información sobre la topología de las proteínas de membrana, las preparaciones mitocondriales se sonican inicialmente y luego se someten a extracción alcalina con carbonato de sodio. Finalmente, después de la centrifugación, las fracciones de pellets y sobrenadantes de estos diferentes tratamientos son analizadas por SDS-PAGE y western blot. La localización submitocondrial así como la topología de membrana de la proteína de interés se obtiene comparando su perfil de western blot con estándares conocidos.
Introduction
Las mitocondrias son orgánulos esenciales de las células eucariotas que desempeñan un papel crucial en la bioenergética, el metabolismo celular y las vías de señalización1. Para ejecutar adecuadamente estas tareas, las mitocondrias dependen de un conjunto único de proteínas y lípidos responsables de su estructura y función. La levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada como sistema modelo para investigaciones sobre procesos mitocondriales, así como para otros orgánulos2. El genoma mitocondrial codifica solo ocho proteínas en la levadura; la gran mayoría de las proteínas mitocondriales (~99%) están codificadas por genes nucleares, que se traducen en ribosomas citosólicos, y posteriormente se importan a sus compartimentos electorales correctos mediante sofisticadas maquinarias de importación de proteínas3,4,5. Así, la biogénesis mitocondrial depende de la expresión coordinada de los genomas nuclear y mitocondrial6,7. Las mutaciones genéticas que causan defectos en la biogénesis mitocondrial están asociadas con enfermedades humanas8,9,10.
En las últimas dos décadas, los estudios proteómicos de alto rendimiento dirigidos a mitocondrias altamente purificadas dieron como resultado una caracterización integral del proteoma mitocondrial de levadura, que se ha estimado que está compuesto por al menos 900 proteínas11,12,13,14. Aunque estos estudios proporcionaron información valiosa, la localización suborganular de cada proteína en los cuatro subcompartimentos mitocondriales, a saber, la membrana externa (OM), el espacio intermembrana (IMS), la membrana interna (IM) y la matriz, todavía es necesaria. Esta cuestión se abordó parcialmente con estudios proteómicos de los dos subcompartimentos mitocondriales más pequeños (OM e IMS)15,16. Más recientemente, Vögtle y sus colaboradores dieron un gran paso adelante al generar un mapa global de alta calidad de la distribución de proteínas submitochondrial en levadura. Utilizando un enfoque integrado que combina espectrometría de masas cuantitativa basada en SILAC, diferentes protocolos de fraccionamiento submitocondrial y el conjunto de datos de los proteomas OM e IMS, los autores asignaron 818 proteínas a los cuatro subcompartimentos mitocondriales13.
A pesar de los avances logrados por estos estudios proteómicos de alto rendimiento, nuestro conocimiento sobre la composición del proteoma submitochondrial está lejos de ser completo. De hecho, entre las 986 proteínas reportadas por Vögtle y colaboradores como localizadas en mitocondrias de levadura, 168 no pudieron ser asignadas en ninguno de los cuatro compartimentos submitocondriales13. Además, los autores no proporcionaron información sobre la topología de membrana de las proteínas que se predijo que estaban unidas periféricamente a la periferia de las membranas mitocondriales. Por ejemplo, no es posible saber si una proteína que fue asignada como periféricamente unida a la membrana interna está frente a la matriz o al espacio intermembrana. Aparte de estos datos faltantes de los estudios de todo el proteoma, hay información contradictoria sobre la localización suborganular de un número significativo de proteínas mitocondriales. Un ejemplo es la proteasa Prd1, que ha sido asignada como una proteína espacial intermembrana en las bases de datos comunes como Saccharomyces Genome Database (SGD) y Uniprot. Sorprendentemente, utilizando un protocolo de subfraccionamiento similar al aquí descrito, Vögtle y colaboradores demostraron claramente que Prd1 es una proteína genuina de la matriz13. Como se mencionó anteriormente, la localización submitocondrial de muchas proteínas mitocondriales necesita ser dilucidada o reevaluada. Aquí, proporcionamos un protocolo simple y confiable para determinar la localización suborganular de las proteínas mitocondriales de levadura. Este protocolo fue desarrollado y optimizado por diversos grupos de investigación y se ha utilizado de forma rutinaria para determinar la localización submitocondrial, así como la topología de membrana de muchas proteínas mitocondriales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo aquí presentado ha sido utilizado con éxito y optimizado continuamente durante mucho tiempo para determinar la localización de proteínas en los compartimentos peticionarios13,14,18,21,22,23. La fiabilidad y reproducibilidad de este protocolo dependen en gran medida de la pureza e integridad de los preparados …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. A. Tzagoloff (Universidad de Columbia) por proporcionar anticuerpos levantados contra las proteínas marcadoras submitochondrial Cyt. b2, αKGD y Sco1. También agradecemos al Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) por la útil discusión y comentarios durante el establecimiento de este protocolo.
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (beca 2013/07937-8).
Fernando Gomes y Helena Turano también cuentan con el apoyo de la FAPESP, las becas 2017/09443-3 y 2017/23839-7, respectivamente. Angélica Ramos también cuenta con el apoyo de la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
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