신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가
Summary
최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
Abstract
효모 미토콘드리아 프로테오메의 특성화에 있는 최근 어드밴스에 있는 진보에도 불구하고, 단백질의 상당수의 제출국국화는 애매하게 남아 있습니다. 여기서, 우리는 미토콘드리아 단백질 기능 용해화 동안 근본적인 단계로 간주되는 효모 미토콘드리아 단백질의 소구체국화를 결정하는 강력하고 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 고도로 순수한 그대로미토콘드리아를 얻는 것으로 구성된 초기 단계를 포함한다. 이러한 미토콘드리아 제제는 단백질제 K(protease)를 사용하여 저혈압(swelling) 및 배양으로 구성된 서브배율 프로토콜을 받게 된다. 붓기 동안, 외부 미토콘드리아 막은 선택적으로 중단되어 단백질Ae K가 막 간 공간 구획의 단백질을 소화할 수 있게 합니다. 병행하여 막 단백질의 토폴로지에 대한 정보를 얻기 위해 미토콘드리아 제제는 처음에는 초음파 처리된 다음 탄산나트륨을 사용하여 알칼리성 추출을 실시한다. 마지막으로, 원심 분리 후, 이러한 다른 치료법에서 펠릿과 상피 분획은 SDS-PAGE 및 서부 블롯에 의해 분석됩니다. 관심 있는 단백질의 막 토폴로지뿐만 아니라 제출된 국소화는 서양 블롯 프로파일을 알려진 표준과 비교하여 얻어진다.
Introduction
미토콘드리아는 생체 에너지, 세포 대사 및 신호 경로1에서 중요한 역할을 하는 진핵 세포의 필수 세포입니다. 이러한 작업을 제대로 실행하기 위해 미토콘드리아는 구조와 기능을 담당하는 독특한 단백질과 지질 세트에 의존합니다. 신진 효모 사카로미세스 cerevisiae 널리 미토콘드리아 프로세스에 대한 조사를위한 모델 시스템으로 사용되었습니다, 뿐만 아니라 다른 세포기관2. 효모에 있는 단지 8개의 단백질을 위한 미토콘드리아 게놈 코드; 미토콘드리아 단백질의 대다수 (~99%)는 세포성 리보솜에서 번역되는 핵 유전자에 의해 인코딩되고, 그 후에 정교한 단백질 수입 기계에 의해 그들의 정확한 제출된 제출으로 수입됩니다3,4,5. 따라서, 미토콘드리아 생물발생은 핵과 미토콘드리아 게놈 6,7의 조정된 발현에 의존한다6,7. 미토콘드리아 생물 발생에 결함을 일으키는 유전 돌연변이는 인간 질병8,9,10과 연관됩니다.
지난 2년간 고정화 미토콘드리아를 대상으로 한 고처리량 프로테오믹 연구는 효모 미토콘드리아 프로테오메의 포괄적인 특성화를 초래했으며, 이는 적어도 900단백질11,12,13,14로 구성된 것으로 추정되고 있다. 이러한 연구는 귀중한 정보를 제공했지만, 4개의 미토콘드리아 하위 구획, 즉 외부 막(OM), 막 간 공간(IMS), 내부 막(IM) 및 매트릭스에서 각 단백질의 소구체화가 여전히 요구된다. 이 질문은 부분적으로 두 개의 작은 미토콘드리아 하위 구획의 프로테오믹 전체 연구로 해결되었다 (OM 및 IMS)15,16. 최근에는 Vögtle과 협력자들은 효모에서 고품질의 글로벌 프로포톤드 단백질 분포지도를 생성하여 큰 진전을 이루었습니다. 저자는 SILAC 기반 정량 질량 분광법, 상이한 제출 분별 프로토콜 및 OM 및 IMS 프로테옴의 데이터 세트를 결합한 통합 된 접근 방식을 사용하여 818 단백질을 4 개의 미토콘드리아 하위 구획13에 할당했습니다.
이러한 높은 처리량 프로테오믹 연구에 의해 달성 된 진보에도 불구하고, 제출 프로테오메 조성에 대한 우리의 지식은 완료되지 않습니다. 실제로, Vögtle및 협력자가 효모 미토콘드리아로 국소화되는 것으로 보고된 986개의 단백질 중, 168개는 4개의 제출된 제출된 구획13에서 할당될 수 없었습니다. 더욱이, 저자는 미토콘드리아 막의 주변에 말초로 부착될 것으로 예상되었던 단백질의 막 토폴로지에 관하여 정보를 제공하지 않았다. 예를 들어, 내막에 말초로 부착된 단백질이 매트릭스 또는 막 간 공간을 향하고 있는지 알 수 없다. 프로테오메 전체 연구에서 이러한 누락 된 데이터 외에도, 미토콘드리아 단백질의 상당수의 suborganellar 국소화에 대 한 충돌 하는 정보가 있다. 한 가지 예는 Saccharomyces 게놈 데이터베이스 (SGD) 및 Uniprot와 같은 일반적인 데이터베이스에 있는 막 간 공간 단백질로 할당된 protease Prd1입니다. 놀랍게도, 여기에 설명된 것과 유사한 과절 프로토콜을 사용하여 Vögtle 및 협력자들은 Prd1이 정품 매트릭스 protein13임을 분명히 보여주었습니다. 위에서 언급했듯이, 많은 미토콘드리아 단백질의 제출국국화는 해명되거나 재평가될 필요가 있다. 여기서, 우리는 효모 미토콘드리아 단백질의 소독제 국소화를 결정하기 위하여 간단하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 연구 그룹에 의해 개발되고 최적화되었으며 많은 미토콘드리아 단백질의 막 토폴로지뿐만 아니라 제출국소화를 결정하는 데 일상적으로 사용되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 성공적으로 사용되고 지속적으로 제출된 본래의 단백질 국소화를 결정하기 위해 장기간 에 최적화되어 있다13,14,18,21,22,23. 이 프로토콜의 신뢰성과 재현성은 미토콘드리아 제제의 순도와 무결성에 크게 의존한다<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 제출 에 대한 제기 항체를 제공 에 이 치골로프 박사 (컬럼비아 대학) 박사 에게 감사드립니다 Cyt. b2, αKGD 및 스코1. 우리는 또한 이 프로토콜의 수립 기간 동안 유용한 토론과 의견에 대한 마리오 헨리크 드 바로스 박사 (Universidade 드 상파울루)에게 감사드립니다.
이 작품은 Fundação 드 Amparo à Pesquisa do Estado de 상파울루 (FAPESP) (보조금 2013/07937-8)의 연구 보조금에 의해 지원되었습니다.
페르난도 고메스와 헬레나 투라노도 FAPESP의 지원을 받으며, 2017/09443-3및 2017/23839-7을 각각 지원합니다. 앙겔리카 라모스는 코르데나샤오 데 아페르페이소아멘토 데 페소알 드 니벨 슈페리어(CAPES)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
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