הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae
Summary
למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.
Abstract
למרות ההתקדמות האחרונה באפיון פרוטאום מיטוכונדריאלי שמרים, לוקליזציה submitochondrial של מספר משמעותי של חלבונים נשאר חמקמק. כאן, אנו מתארים שיטה חזקה ויעילה לקביעת לוקליזציה תת-אורגנית של חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים, אשר נחשב צעד בסיסי במהלך הפרטרה פונקציית חלבון מיטוכונדריאלי. שיטה זו כרוכה בצעד ראשוני המורכב מהשגת מיטוכונדריה שלמה טהורה מאוד. תכשירים מיטוכונדריאליים אלה כפופים לאחר מכן לפרוטוקול תת-ניתוח המורכב מהלם היפוטוני (נפיחות) ודגירה עם פרוטאז K (פרוטאז). במהלך הנפיחות, הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית משובשת באופן סלקטיבי, ומאפשרת לחלבון-ase K לעכל חלבונים של תא החלל הבין-ימי. במקביל, כדי לקבל מידע על הטופולוגיה של חלבוני ממברנה, ההכנות המיטוכונדריאליות הם בתחילה sonicated, ולאחר מכן נתון מיצוי אלקליין עם נתרן קרבונט. לבסוף, לאחר צנטריפוגה, הכדור ושברים על טבעיים מטיפולים שונים אלה מנותחים על ידי SDS-PAGE וכתם מערבי. לוקליזציה submitochondrial, כמו גם את טופולוגיית הממברנה של חלבון העניין מתקבל על ידי השוואת פרופיל כתם המערבי שלה עם סטנדרטים ידועים.
Introduction
המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אאוקריוטים הממלאים תפקידים מכריעים בביו-אנרגטיקה, חילוף חומרים תאי ומסלולי איתות1. כדי לבצע כראוי משימות אלה, המיטוכונדריה מסתמכת על קבוצה ייחודית של חלבונים ושומנים האחראים על המבנה והתפקוד שלהם. שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל עבור חקירות על תהליכים מיטוכונדריאליים, כמו גם עבור אברונים אחרים2. קודי הגנום המיטוכונדריאליים לשמונה חלבונים בלבד בשמרים; הרוב המכריע של החלבונים המיטוכונדריאליים (כ-99%) מקודדים על ידי גנים גרעיניים, המתורגמים לריבוזומים ציטוזוליים, ולאחר מכן מיובאים לתאי השליחה הנכונים שלהם על ידי מכונות ייבוא חלבונים מתוחכמות3,4,5. לפיכך, ביוגנזה מיטוכונדריאלית תלויה בביטוי המתואם של הגנום הגרעיני והמיטוכונדריאלי6,7. מוטציות גנטיות הגורמות לפגמים בביוגנזה מיטוכונדריאלית קשורות למחלות אנושיות8,9,10.
בשני העשורים האחרונים, מחקרים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה המתמקדים במיטוכונדריה מטוהרת מאוד הביאו לאפיון מקיף של פרוטאום מיטוכונדריאלי שמרים, אשר הוערך כי הוא מורכב לפחות 900 חלבונים11,12,13,14. למרות שמחקרים אלה סיפקו מידע רב ערך, לוקליזציה תת-אורגנית של כל חלבון בארבעת תתי-הדירות המיטוכונדריאליות, כלומר, הממברנה החיצונית (OM), המרחב הבין-משרדי (IMS), הממברנה הפנימית (IM) והמטריקס, עדיין נדרשת. שאלה זו טופלה בחלקה במחקרים פרוטאומיים של שתי תתי-התת-קומפרטציות המיטוכונדריאליות הקטנות יותר (OM ו- IMS)15,16. לאחרונה, Vögtle ומשתפי פעולה עשו צעד גדול קדימה על ידי יצירת מפה גלובלית באיכות גבוהה של הפצת חלבון submitochondrial בשמרים. באמצעות גישה משולבת המשלבת ספקטרומטריית מסה כמותית מבוססת SILAC, פרוטוקולי שברים שונים של submitochondrial, ואת ערכת הנתונים מפרוטומים OM ו- IMS, המחברים הקצו 818 חלבונים לארבעת תתי-ההפרשות המיטוכונדריאליות13.
למרות ההתקדמות שהושגו על ידי מחקרים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה אלה, הידע שלנו על הרכב הפרוטאום ההגשה רחוק מלהיות שלם. ואכן, בין 986 חלבונים שדווחו על ידי Vögtle ומשתפי פעולה כמו להיות מקומי לתוך מיטוכונדריה שמרים, 168 לא יכול להיות מוקצה בכל אחד מארבעת התאים submitochondrial13. יתר על כן, המחברים לא סיפקו מידע על טופולוגיית הממברנה של חלבונים שהיו צפויים להיות מחוברים באופן היקפי לפריפריה של ממברנות מיטוכונדריאליות. לדוגמה, לא ניתן לדעת אם חלבון שהוקצה כמו מחובר היקפית לממברנה הפנימית פונה למטריצה או לחלל הבין-משרדי. מלבד נתונים חסרים אלה ממחקרים ברחבי פרוטאום, ישנם מידע סותר על לוקליזציה תת-אורגנית של מספר משמעותי של חלבונים מיטוכונדריאליים. דוגמה אחת היא פרוטאז Prd1, אשר הוקצה כחלבון חלל בין-משרדי במסדי הנתונים הנפוצים כגון מסד נתונים גנום Saccharomyces (SGD) ו Uniprot. באופן מפתיע, באמצעות פרוטוקול תת-תרגול דומה לזה המתואר כאן, Vögtle ומשתפי פעולה הראו בבירור כי Prd1 הוא חלבון מטריצה אמיתי13. כפי שהוזכר לעיל, לוקליזציה גש של חלבונים מיטוכונדריאליים רבים צריך להיות מבורר או הערכה מחדש. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פשוט ואמין כדי לקבוע את לוקליזציה תת-אורגנית של חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים. פרוטוקול זה פותח ואופטימיזציה על ידי קבוצות מחקר שונות, שימש באופן שגרתי כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial, כמו גם את טופולוגיית הממברנה של חלבונים מיטוכונדריאליים רבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן נעשה שימוש מוצלח ואופטימיזציה רציפה במשך זמן רב כדי לקבוע את לוקליזציה חלבון בתאי submitochondrial13,14,18,21,22,23. האמינות והשחזור של פרוטוקול זה תלויים מאוד בטוהר ושלמות ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר א. ציגלוף (אוניברסיטת קולומביה) על אספקת נוגדנים שהועלו כנגד חלבוני סמן קשירת ים Cyt. b2, αKGD וסקו1. אנו מודים גם לד”ר מריו הנריקה דה בארוס (Universidade de São Paulo) על דיון והערות מועילות במהלך הקמת פרוטוקול זה.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (grant 2013/07937-8).
פרננדו גומס והלנה טוראנו נתמכים גם על ידי FAPESP, מענקים 2017/09443-3 ו 2017/23839-7, בהתאמה. Angélica Ramos נתמך גם על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
- Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
- Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
- Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
- Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
- Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
- Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
- Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
- Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
- Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).
- Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
- Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
- Vögtle, F. -. N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
- Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
- Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
- Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
- Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
- Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).
- Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
- Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
- Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
- Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
- Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).
